Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ концевых групп и ступенчатая деградация белков и пептидов
Определение N-концевых групп 2,4-динитрофторбензольным методом
Количественное определение ДНФ-производных

ДНФ-фракцию, полученную из смесей с известным количеством белка или пептида, хроматографируют вместе с определенным количеством контрольных ДНФ-аминокислот, после чего ДНФ-аминокислоты элюируют из бумаги и определяют их содержание фотометрически по калибровочной кривой, построенной для ДНФ- аминокислот. Таким способом можно определить концевые группы белков и пептидов, число полипептидных цепей белков, минимальный молекулярный вес белков и аминокислотный состав белковых гидролизатов.

МЕТОДИКА

А. Определенное количество контрольного ДНФ-производного гидролизуют в 6 н. НСl в тех же условиях, в которых проводили гидролиз ДНФ-белка или ДНФ-пептида. Гидролизат экстрагируют эфиром, органическую фазу упаривают и растворяют в небольшом измеренном количестве метанола. Аликвоты такого контрольного раствора наносят на бумагу.

Б. Известное количество изучаемой ДНФ-фракции хроматографируют на бумаге в условиях, необходимых для данного ДНФ-производного. Пробы контрольного препарата, содержащие различное количество вещества, хроматографируют на том же листе бумаги. По окончании хроматографии пятна ДНФ-аминокислот вырезают вместе с контрольными, бумагу измельчают на мелкие кусочки и помещают в пробирки. В каждую пробирку наливают по 5 мл 1 %-ного раствора NaHCО₃ и в течение 30 мин при периодическом встряхивании в темноте производят элюирование проб. Экстинкцию растворов при 360 нм измеряют в спектрофотометре. Содержание ДНФ-аминокислот в исследуемой фракции определяют по калибровочной кривой, построенной для контрольных образцов.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Использование контрольных проб, обработанных так же, как изучаемые образцы, устраняет ошибки, связанные с разрушением в ходе гидролиза. Поскольку содержание ДНФ-производных определяют по калибровочным кривым, построенным для контрольных образцов, с которыми проводились точно те же операции, что и с исследуемыми образцами, ошибки за счет неконтролируемых факторов метода (разрушение под действием света, потери в ходе приготовления и экстракции и др.) компенсируются.

2. ДНФ-Про фотометрируют при 385 нм, а ДНФ-пептиды — при 350 нм.

3. Если пользуются ранее построенными калибровочными кривыми, с помощью поправочных коэффициентов их следует привести к условиям данного эксперимента.