Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Газохроматографический анализ производных аминокислот. Состояние проблемы. Возможности и ограничения метода
Специальные требования к приборам и экспериментальные условия ГХ-анализа производных аминокислот и пептидов

Рабочая температура

Поскольку почти все виды производных аминокислот представляют собой молекулы с выраженной полярностью, обладающие ограниченной химической устойчивостью и заметной термолабильностью, необходимо подбирать для проведения анализа оптимальную температуру.

Контроль температуры должен распространяться на все ступени процесса: важна как температура, при которой образец вводится, так и температура конструктивных элементов трубок, главным образом металлических. Следует еще раз подчеркнуть, что процесс разделения, избирательность и время удерживания существенно зависят от температуры. Природные смеси аминокислот всегда сложны. Практически невозможно выполнить полный анализ смеси при одной температуре, поскольку, какой бы образец ни фракционировался, в смеси обычно присутствуют как высоко-, так и низкомолекулярные соединения с разной степенью полярности. Из сказанного ранее следует, что метод с программированием температуры является лишь разновидностью многоколоночного метода, в котором, например, три колонки используются при трех различных температурах, а детектор присоединен к каждой колонке. В таком ступенчатом температурном методе объединяются достоинства изотермического метода и метода программирования температуры — правда, при этом предъявляются очень высокие требования к аппаратуре. Макисуми и Сароф [60] воспользовались этим комбинированным методом для разделения метиловых эфиров трифторацетиламинокислот (ТФА-аминокислот).

Особое преимущество ГХ с программированием температуры состоит в возможности работы с относительно холодным дозатором. Это позволяет предотвратить первичное термическое разложение анализируемого вещества даже при его высокой концентрации или в присутствии соединения, способного с ним реагировать. Более того, ГХ с программированием температуры (ТГХ) обеспечивает оптимальную температуру разделения для любой пары веществ, чего нельзя достичь для всех компонентов на изотермической колонке. Вместе с тем ТГХ более сложна, чем изотермический анализ: длина колонки, способ пропитки и другие методические факторы не могут выбираться произвольно, а должны быть тщательно согласованы.

Существуют серьезные сомнения в отношении ценности слишком длинных колонок при ТГХ-анализе некоторых производных аминокислот [16]. Однако причиной того, что в определенных случаях разделение проходило хорошо на коротких колонках (от 0,5 до 2 м) и не удавалось на длинных (более 3—5 м), являются, по-видимому, структурные отличия и различная температурная зависимость относительных удерживаемых объемов полярных веществ. Эти трудности, возможно, удалось бы преодолеть подбором подходящего носителя и соответствующих количеств определенной жидкой фазы. Оптимальная скорость нагревания (град/мин) предопределена длиной колонки и общим количеством жидкой фазы, причем поток газа при этом должен тщательно регулироваться. Совершенно очевидно, что температура во всем объеме термостата не должна изменяться более чем на ±0,5°С, однако ряд выпускаемых приборов не удовлетворяет этому требованию.

Величины удерживаемых объемов полярных соединений особенно чувствительны к температуре. Колебания неустановившейся температуры в разделяющей системе снижают четкость и, следовательно, эффективность разделения.

Ввод образца

Как уже упоминалось, при проведении ТГХ дозатор должен быть как можно более охлажденным. В то время как при изотермической ГХ дозатор должен иметь температуру, более высокую, чем нижний предел интервала кипения исследуемой смеси, в ТГХ в крайних случаях он может нагреваться до температуры, которая на 150°С ниже точки кипения самой высококипящей фракции образца, если соблюдаются следующие условия: а) образец должен иметь минимально возможный объем, менее 1 мкл; б) при внесении образца не должно происходить его охлаждения; в системе должна быть обеспечена хорошая теплопроводность и теплоемкость; в) система должна быть химически инертной (поверхности должны быть чистыми, каталитически неактивными; обычно они состоят из окиси титана или кварца с наполнителями, повышающими теплоемкость); г) дозатор должен иметь съемные поверхности для испарения, чистоту которых можно легко проверять; д) температура дозатора должна быть стабильной, легко регулироваться и измеряться; температура влияет на количественную оценку хроматограммы, поскольку от нее зависит форма и высота пиков (если образец переохлажден, наблюдаются “хвосты”).

Материалы для набивки колонок

Материал, используемый для набивки колонок, должен быть инертным. Для многих аналитических задач, которые в принципе могли бы быть решены ГХ, трудности связаны с химической активностью материала колонок. Стеклянные и кварцевые колонки позволяют, например, проводить количественный анализ следов кислот или прямой анализ перекисей (в первом случае благодаря уменьшенной адсорбции, а во втором — благодаря инертности материала), если в колонках не присутствуют металлы (медь, даже посеребренная или позолоченная, обычная или специальная сталь). Иногда нанесение на поверхность колонки пленки жидкой фазы очень хорошо сказывается, на результатах эксперимента. Однако при этом необходима тщательная очистка и специальное импрегнирование, включающие описываемые ниже операции. Хорошо очищенную колонку заполняют дезактивированным носителем, который подвергали просеву, нагревают, например до 300°С сухим током азота, затем охлаждают и промывают жидкой фазой в нужной концентрации и в подходящем растворителе. Отмывку заканчивают, когда состав импрегнирующей смеси, подаваемой на колонку и выходящей с нее, становится одинаковым. После этого избыточную жидкость удаляют газом, а колонку высушивают в токе газа при достаточно высокой температуре. Температура колонки должна несколько повышаться на выходе колонки, чтобы избежать конденсации растворителя.

Для описанной процедуры пригодна любая температура, при которой не происходит неравномерного импрегнирования за счет локального концентрирования импрегнирующего раствора.

Если анализируемое вещество вводят не с помощью дозатора, а непосредственно в колонку или если колонка работает при высоких температурах, когда разделяющая жидкость заметно испаряется, то приходится считаться с присутствием в первой части колонки каталитически активного неимпрегнированного носителя в течение нескольких часов. Это обстоятельство может неблагоприятно сказываться на анализе, поскольку образец еще находится в нефракционированном и относительно концентрированном состоянии именно в этом месте, и, следовательно, здесь могут протекать химические реакции, искажающие ГХ-анализ.

Если нельзя набить всю колонку хромосорбом Т, следует набить этим очень инертным веществом хотя бы первую часть колонки. При тщательной набивке можно приготовить колонку, имеющую 1000 теоретических тарелок на метр (для сравнения: с хромосорбом В можно получить 1400 теоретических тарелок на метр для полярных разделяющих жидкостей и рабочей температуры 200°С; другие носители могут обладать даже более высокой разделяющей способностью).

Абсолютная инертность вещества-носителя не обязательна, если разделение ведут в капиллярах [19, 24, 44]. Хотя анализ полярных веществ в капиллярах также имеет свои недостатки, однако он все еще привлекает своей высокой разрешающей способностью при фракционировании аминокислот методом ГХ (разрешающая способность капилляра длиной 50 м с внутренним диаметром 0,25 мм достигает от 50 000 до 100 000 теоретических тарелок). По приготовлению материалов для набивки колонок в настоящее время существует обширная литература.

Различными фирмами выпускается большое количество разнообразных носителей (например, фирмами Beckman Instruments Ltd., F&M Scientific, Abteilung Chemie der Hewlett-Packard Vertriebs GmbH, May and Baker Ltd., Perkin-Elmer and Co. GmbH), однако для анализа производных аминокислот необходима оптимальная наладка колонки в соответствии с конкретной задачей. Это касается не столько таких параметров колонки, как перепад давления и допустимое минимальное время анализа, сколько ее разделяющей способности (выражаемой числом теоретических тарелок на метр), равной

где n — число теоретических тарелок изотермической колонки (или капилляра); L — длина колонки (капилляра) в м; t_br — полное время удерживания исследуемого образца; t_r — время удерживания исследуемой фракции (t_br = t_r+ t_b, t_b — время проскока; w_0,5 — ширина пика на половине высоты (полуширина пика).

В еще большей степени важна избирательность. Хотя в основном она определяется разделяющей жидкостью, в случае полярных веществ, какими являются все производные аминокислот, на нее оказывают влияние также свойства носителя, количество жидкой фазы на носителе и температура.

Все эти замечания сводятся к тому, что любые температурные данные о пригодности или непригодности жидкой фазы или набивочного материала колонки для определенного анализа должны рассматриваться критически. Если, например, сообщается о том, что в полиэфирной жидкой фазе аминокислоты разрушаются, то все же возможно, что трудности устранимы при более интенсивном, полном и равномерном импрегнировании или при выборе других материалов для носителя и колонки. В ГХ аминокислот большую роль играет хорошо подготовленная хроматографическая колонка — это основа качественного анализа и необходимое условие для количественного. Главная трудность хроматографии полярных веществ связана с наличием значительного “хвостового эффекта”. Но и в этом случае химическая модификация носителей и поверхности колонки наряду с очисткой разделяющей жидкости и импрегнирующих веществ могут способствовать успеху в экспериментах.

Следы кислорода в импрегнирующем растворе или в газе-носителе могут сделать набивочный материал колонки химически активным за счет окисления. Следует также иметь в виду, что некоторые полярные вещества хорошо разделяются и элюируются только после того, как через колонку уже пропустили несколько образцов.

Поскольку каждый раз приходится учитывать множество различных факторов, простых и универсальных правил не существует. Действительно, опыт показывает, что приготовление хорошей хроматографической колонки — это почти искусство, требующее трудоемких и кропотливых экспериментов. Если 7 из 10 колонок для разделения полярных веществ оказываются хорошими (имеют от 1200 до 1500 теоретических тарелок на метр, обладают удовлетворительной механической и химической устойчивостью, а при фракционировании образцов в них отсутствуют “хвосты”), то можно быть довольным таким результатом. Подробный обзор простых технических операций приготовления колонок сделан Баро [3]. Жидкие фазы, использованные до настоящего времени для аминокислотного анализа, перечислены в табл. 13.

Таблица 13 Жидкие фазы для ГХ-анализа производных аминокислот