Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Некоторые методологические вопросы аналитического исследования белков
Изучение нативных белков

Быстрое развитие ряда отраслей биологии началось всего лишь сто лет назад. Примерно тогда же было начато систематическое изучение белков, представляющее собой в известной мере более трудную задачу, чем, например, решение некоторых проблем физиологии или фармакологии. Основная трудность в изучении белка заключается в том, что объект исследования представляет собой очень большую и, по-видимому, чрезвычайно лабильную молекулу с исключительно сложной структурой. Поэтому разработка методов выделения и изучения нативных, неденатурированных белков происходила довольно медленно. Однако в последние два десятилетия, когда разработка методов анализа белков вступила в фазу быстрого и всестороннего развития, белковая химия сделала гигантский шаг вперед. Среди выдающихся достижений последних 10—15 лет видное место занимает расшифровка первичной структуры ряда белков. Вместе с тем и сейчас изучение структуры любого сколько-нибудь сложного белка является весьма серьезной задачей.

В последние годы благодаря развитию аналитических методов изучение нативных белков приобретает все возрастающее значение как в химических, биохимических и медицинских исследованиях, так и в клинической практике. В книге, целью которой является детальное описание методов анализа белка, было бы затруднительно давать подробный обзор результатов, полученных при использовании того или иного метода, и вполне естественно, что этого нельзя требовать от руководства, предназначенного для определенных практических задач. Мы решили, что будет наиболее целесообразным на тщательно подобранных примерах проиллюстрировать возможности и ограничения того или иного аналитического метода.

Хорошим примером изучения нативных белков является исследование белков сыворотки крови, включающее их выделение, очистку, количественный и качественный анализ. Широкое применение методов анализа белков будет показано нами именно на примере изучения сывороточных белков.

Открыв весьма широкие перспективы анализа белков вообще, разнообразные методы электрофоретического и иммунохимического исследования, а также хромотография и гель-фильтрация позволили в то же время обнаружить ряд новых белков сыворотки. Это в свою очередь не только способствовало выяснению деталей некоторых физиологических и патофизиологических процессов, но в значительной степени стимулировало изучение основных иммунологических явлений, расшифровку структуры белков и т. д. Разумеется, приводимые нами материалы о белках сыворотки нельзя считать исчерпывающими. Мы стремились познакомить читателя лишь с теми возможностями, которые открывает каждый из описанных методов, и надеемся, что настоящее руководство окажется полезным при выборе наиболее подходящего метода, а также при интерпретации полученных результатов для исследователей, работающих как с сывороточными, так и с другими белками.

В 1878 г. Хаммарстену удалось с помощью высаливания насыщенным сульфатом магния отделить глобулины от альбуминов сыворотки. Это открытие резко изменило существовавшее тогда представление о сывороточных белках. Применение сульфата магния положило начало целой серии методов фракционирования белков путем высаливания. В течение нескольких десятилетий процедура высаливания была единственно доступной как в клинических, так и в научных исследованиях белков крови. На этом этапе сывороточные белки крови были охарактеризованы по их растворимости в воде и в растворах солей разной концентрации. На основании этих данных стали различать нерастворимую в воде фракцию — эуглобулин и растворимые — псевдоглобулин и альбумин.

Классическое определение глобулинов сыворотки связано с высаливанием ее сульфатом аммония, поскольку глобулинами называют белки, выпадающие в осадок при полунасыщении сыворотки этой солью.

Фракционирование белков высаливанием не свободно от недостатков. Оно не дает достаточно четкого разделения индивидуальных компонентов смеси. Концентрации солей, осаждающие ту или иную фракцию белков нормальной сыворотки, могут отличаться от концентраций, необходимых для фракционирования сывороток, содержащих “патологические” белки и т. д. Несмотря на это, до сих пор высаливание широко используется в клинических лабораториях для разделения глобулинов и альбумина, так как этот прием является относительно простым и быстрым способом определения альбумин-глобулинового коэффициента (А/Г-коэффициент).