Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков методами диффузии в геле
Метод двойной (одномерной) линейной диффузии в геле

Принцип метода. Раствор белкового антигена и иммунная сыворотка диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу и образуют преципитат.

Область применения. Определение минимального числа компонентов в белковых смесях.

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

1. Пробирки длиной 60—80 мм и внутренним диаметром 2—3 мм.

2. Капиллярные (пастеровские) пипетки.

МЕТОДИКА

1. Очистка агара и приготовление геля (см. стр. 127).

2. Нанесение агаровой пленки на внутреннюю поверхность пробирок (см. стр. 128).

3. Постановка реакции. При помощи капиллярной пипетки смесь расплавленного агара и иммунной сыворотки наливают на высоту ~20 мм в пробирки, покрытые изнутри агаровой пленкой.

Приготовление смеси агара с иммунной сывороткой. Расплавленный в физиологическом растворе 0,6%-ный агар охлаждают до температуры 46—48°С и смешивают с равным объемом подогретой до этой же температуры иммунной сыворотки.

После того как внесенная в пробирки смесь агара и антисыворотки затвердеет, сверху наносят 0,3%-ный расплавленный агар на высоту 8—10 мм. Как только затвердеет и этот слой, на него наслаивают смесь расплавленного агара с раствором антигена на высоту 20 мм.

Приготовление смеси агара с раствором антигена. Расплавленный 0,6%-ный агар при температуре 46—48°С смешивают с равным объемом раствора антигена.

Пробирки, заполненные тремя слоями агара, заливают парафином и оставляют при комнатной температуре.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. При использовании антисыворотки с высоким титром уже через несколько часов после постановки реакции в промежуточном слое агара появляется одна или несколько полос преципитации. Если используемая антисыворотка имеет низкий титр антител или применяется в большом разведении, то образование полос преципитации происходит через несколько дней.

2. Полосы преципитации, как правило, располагаются в том участке геля, в котором создается оптимальное соотношение концентраций антигена и антител. При относительно большем разведении антисыворотки реакция преципитации происходит вблизи границы агара, содержащего иммунную сыворотку. Если же используются относительно разбавленные растворы антигена, реакция преципитации наблюдается ближе к границе агарового слоя, содержащего антиген. В соответствии с этим располагаются полосы преципитации.

3. Положение полос преципитации можно охарактеризовать величиной р, которая выражает в процентах отношение расстояния между нижней границей агарового слоя, содержащего антиген, и полосой преципитации ко всей длине промежуточного слоя агара, который первоначально не содержал ни антигена, ни антител.

4. Метод одномерной диффузии в агаре удобен главным образом для качественного анализа. По числу образующихся полос преципитации можно судить о минимальном числе разных антигенных компонентов, которые реагируют с антителами соответствующей специфичности в данной системе.