Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков методами диффузии в геле
Качественный и количественный анализ белков с помощью электрофореза в геле агарозы, содержащем антитела

Принцип метода. Анализ включает две стадии: а) электрофорез исследуемого белка в геле агарозы и б) повторный электрофорез полученных фракций в геле, содержащем антитела, перпендикулярно к направлению первого разделения. Полоску геля, содержащего фракции исследуемого белка, полученные на первой стадии, помещают на пластинку геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вновь проводят электрофоретическое разделение под прямым углом к первоначальному направлению. О концентрации различных фракций исследуемого белка можно судить по высоте преципитационных пиков, образующихся в результате миграции антигена в геле, содержащем антитела.

Область применения. Идентификация и количественный анализ белковых фракций.

МЕТОДИКА

1. Приготовление пластинки геля агарозы. 1 %-ный раствор агарозы, содержащий 1 ммоль лактата кальция, готовят на вероналовом буферном растворе с ионной силой 0,05 и pH 8,6.

Подогретую агарозу наслаивают на предметное стекло так, чтобы получился слой геля толщиной 1,5 мм; стекла помещают во влажную камеру и оставляют в холодильнике до затвердения.

После этого в катодной трети агарозной пластинки вырезают прямоугольный желобок для исследуемого антигена (фиг. 33).

2. Электрофорез. Раствор антигена (исследуемого белка или смеси белков) вносят в желобок и проводят электрофорез в течение 3 ч при градиенте напряжения 10 В/см.

Рекомендуется использовать электрофоретический прибор с охлаждением. По окончании электрофореза область разделения исследуемого образца в агарозном геле вырезают в виде узкой продольной полосы, содержащей белковые фракции (фиг. 33), и помещают ее на пластинку агарозного геля с иммунной сывороткой.

3. Приготовление геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вторая стадия анализа (электрофорез фракций, полученных на первой стадии). Специфическую иммунную сыворотку в соответствующем разведении смешивают с 1%-ной агарозой и наслаивают на стеклянную пластинку размером 10 х 10 см слой толщиной 1,5 мм.

Фиг. 33. Анализ белков с помощью электрофореза в геле агарозы, содержащем антитела (объяснения см. в тексте).

На эту пластинку кладут полоску геля с фракциями исследуемого белка и проводят электрофорез. Пластинку укрепляют в приборе так, чтобы миграция белковых фракций происходила под прямым углом к продольной оси наложенной полоски агарозного геля (фиг. 33). Электрофорез продолжается 30—90 мин при градиенте напряжения 10 В/см. В ходе электрофореза белковые фракции диффундируют из полоски в гель, содержащий антитела. Мигрируя в нем под действием электрического поля, они образуют преципитационные “пики” в результате специфической реакции с соответствующими антителами. Контуры преципитационных пиков формируются благодаря электрофоретической миграции антигена, а также постепенному уменьшению его избытка в результате этой миграции в геле агарозы. (Известно, что избыток антигена растворяет иммунные преципитаты, поэтому полосы преципитации образуются только там, где избыток антигена исчезает благодаря электрофоретической миграции.)

4. Высота преципитационных пиков, т. е. расстояние между полоской геля, в которой первоначально содержались белковые фракции, и вершиной пика, пропорциональна концентрации антигенов.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. В предварительных опытах рекомендуется уточнить оптимальное соотношение раствора агарозы и иммунной сыворотки в конкретных условиях, т. е. для данного исследуемого антигена и для имеющейся в распоряжении антисыворотки. Если иммунная сыворотка достаточно активна, to ее концентрация в агарозном геле не должна превышать 1—5%.

2. Этот метод позволяет определять концентрацию данного белка в белковой смеси при условии, что исследователь располагает соответствующей моноспецифической антисывороткой. В качестве примера ниже описана методика определения концентрации IgG в сыворотке крови.

На стеклянную пластинку обычным способом наносят 1 %-ный гель агарозы, содержащий 2,5%-ную иммунную сыворотку анти-IgG. В затвердевшем геле агарозы вырезают нужное число круглых лунок для исследуемой сыворотки и IgG и заливают в них по несколько капель агарозного раствора. Препараты IgG известной концентрации в соответствующем разведении вносят в несколько лунок; в остальные лунки заливают образцы исследуемых сывороток и проводят электрофорез, как описано выше. В зависимости от соотношения концентрации антигена и антител продолжительность электрофореза может варьировать от 2 до 10 ч. Электрофорез следует закончить, когда прекратится увеличение преципитационных пиков, т. е. когда избыток антигена будет нивелирован электрофоретической миграцией. По окончании электрофореза измеряют расстояние от вершины пика до центра лунки, из которой началась миграция исследуемого образца. Полученная величина прямо пропорциональна концентрации антигена, в данном случае IgG, в лунке. Основываясь на данных, полученных при соответствующих разведениях препарата IgG известной концентрации, на миллиметровке строят калибровочную кривую, по которой определяют концентрацию IgG в исследуемых образцах сывороток.

3. Количественную оценку результатов и фоторегистрацию преципитационных пиков можно проводить как на нативных, так и на окрашенных препаратах.