Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Гель-фильтрация белков и пептидов
Выделение IgG из сыворотки крови с помощью бесколоночного фракционирования на ДЭАЭ-сефадексе
Обессоливание белковых растворов на колонке с сефадексом

Принцип метода. Содержащиеся в белковых растворах соли как низкомолекулярные вещества при. гель-фильтрации проникают в частицы геля, и поэтому их миграция в геле замедляется. В то же время белки благодаря высокому молекулярному весу без задержки проходят через колонку с гелем сефадекса вместе с фронтом элюата.

МЕТОДИКА

1. Подготовка колонки. Для обессоливания 100 мл белкового раствора необходимо примерно 25 г сухого сефадекса G-25. Объем раствора, из которого требуется удалить соли, должен быть не более одной пятой объема геля, заполняющего колонку.

Сухой сефадекс суспендируют с перемешиванием в 0,05 М трисбуфере pH 7,2. После оседания частичек геля надосадочную жидкость, которая иногда может быть мутной, декантируют. Суспендирование в свежих порциях буферного раствора и отстаивание повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. 'Затем суспензию заливают в колонку, некоторое время ждут, пока осядут частички геля, и после этого открывают выходное отверстие из колонки для того, чтобы выпустить буферный раствор, уровень которого должен достичь уровня сефадекса.

2. Обессоливание. Белковый раствор пропускают через гель сефадекса. Содержание белка в обессоленных фракциях определяют либо по оптической плотности при 280 нм, либо в реакции осаждения белка трихлоруксусной кислотой.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Обессоливание является одной из форм группового разделения, при котором фракционируемые соединения элюируются двумя фракциями. Одна фракция (в данном случае высокомолекулярные соединения — белки) элюируется в свободном объеме. Другая — содержащая низкомолекулярные соединения — проникает в частички геля и поэтому в процессе элюирования выходит из колонки значительно позже, хорошо отделяясь от первой.

2. При групповом разделении смеси высокомолекулярные соединения не фракционируются. Гель-фильтрация в данном случае, подобно диализу, используется для отделения белков от низкомолекулярных примесей и может заменить его. Обессоливание белков можно проводить на сефадексах G-25 и G-50, а также на биогелях Р6 и Р10. Для обессоливания пептидов следует применять: сефадексы G-10 и G-15 или биогели Р2 и Р4.

3. Для группового разделения целесообразно использовать короткие хроматографические колонки длиной 20—30 см. Объем геля должен не менее чем в 4 раза превышать объем обессоливаемого раствора.