Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Гель-фильтрация белков и пептидов
Разделение высокомолекулярных фрагментов гель-фильтрацией с сефадексом

При анализе структуры белков очень часто приходится сталкиваться с изучением фрагментов, полученных при ферментативном гидролизе. Препаративное разделение таких фрагментов — один из этапов исследования белков. Весьма подходящим способом разделения фрагментов ферментативно расщепленных белков можно считать гель-фильтрацию на колонке сефадекса соответствующей марки. Очень хороший пример, демонстрирующий использование указанного метода, — разделение фракций IgG, гидролизованного папаином в присутствии или в отсутствие восстановителей. Если папаиновый гидролиз протекает в отсутствие восстановителей, то часть молекул IgG остается нерасщепленной, тогда как остальные молекулы расщепляются с образованием двух крупных хорошо изученных фрагментов (Fab и Fc) и мелких низкомолекулярных, частично способных проходить через мембрану при диализе пептидов. Молекулярный вес нативного IgG — 150 000, фрагментов Fab и Fc — около 50 000, мелкие пептиды имеют молекулярный вес 5 000 и ниже. Гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-100 позволяет довольно легко разделить эти три фракции папаинового гидролизата IgG.

1. Обработка сефасесса G-W0. Соответствующее количество сухого сефадекса G-100 суспендируют в дистиллированной воде и после отстаивания мелкие плавающие в надосадочной жидкости частицы декантируют. Процедуру удаления мелких частиц повторяют несколько раз до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет совершенно прозрачной. После этого сефадекс оставляют на сутки для набухания в дистиллированной воде. Набухший гель сефадекса уравновешивают 0,075 М фосфатным буферным раствором pH 7,0, содержащим 0,075 М NaCl, и загружают в колонку.

2. Гель-фильтрация. Для фракционирования папаинового гидролизата примерно 100 мг IgG используют колонку размером 2х60 см. После нанесения препарата его остатки смывают тремя порциями буферного раствора по 4 мл и начинают гель-фильтрацию со скоростью 40—60 мл/час. На кривой оптической плотности элюата появляются два следующие непосредственно друг за другом пика, а через некоторое время после них — третий пик. Фракция элюата, соответствующая первому пику, содержит негидролизованный IgG (резистентные к папаину молекулы IgG). Во фракции, соответствующей второму пику, содержатся Fab- и Fc-фрагменты. Третья фракция, соответствующая на диаграмме третьему пику, состоит из низкомолекулярных пептидов. После пропускания через колонку одного объема буферного раствора ее можно использовать вновь.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Выбор хроматографической колонки. Используемые для хроматографии колонки должны иметь определенную конструкцию. Независимо от типа колонки “холостое” пространство у ее дна должно быть минимальным. Если объем “холостого” пространства довольно большой, может происходить смешивание уже разделенных фракций, что будет снижать эффективность фракционирования. Необходимо следить за тем, чтобы частицы геля не забивали поры в расположенной на дне колонки поддерживающей пористой пластинке из стекла или металла. Для этого на пористую пластинку кладут кружок фильтровальной бумаги соответствующего размера. Очень удобны в работе колонки, изготовляемые фирмой Pharmacia Ltd. (Швеция); они практически лишены “холостого” пространства и позволяют вести хроматографию в обоих направлениях.

2. Длина колонки, объем наносимого препарата. Вообще для группового разделения удобны короткие (20—30 см), а для фракционирования — более длинные (до 100 см) хроматографические колонки. При аналитической гель-хроматографии объем наносимого препарата должен быть небольшим, но все же не менее 0,02 объема геля. При препаративной гель-хроматографии стараются наносить тот максимальный объем образца, при котором еще достигается требуемая степень разделения.

3. Диаметр колонки. В колонках широкого диаметра (20—30 мм) “пристеночный” эффект в меньшей степени препятствует разделению, поэтому широкие колонки удобнее в работе и дают лучшие результаты, чем узкие (диаметром 10 мм и меньше) и длинные. Однако для аналитической гель-хроматографии целесообразно использовать колонки диаметром 10 мм.

4. Заполнение колонки. Проще всего можно заполнить колонку с помощью трубки равного с ней диаметра. Такой дополнительной трубкой следует удлинить колонку сверху примерно на одну треть ее высоты. На нижний конец колонки надевают пластмассовый капиллярный шланг такой длины, чтобы его конец можно было закрепить на 4—5 см ниже верхнего конца дополнительной трубки. Суспензии набухшего геля сефадекса дают отстояться и после этого удаляют избыток надосадочной жидкости, так чтобы оставшийся ее слой составлял примерно половину объема геля. Осторожно перемешав гель сефадекса, суспензию переливают по стеклянной палочке в колонку, удлиненную дополнительной трубкой. Рекомендуется по возможности залить в колонку в один прием весь необходимый объем суспензии. Затем сефадекс оставляют на 15—20 мин для оседания гранул и открывают кран, выпускающий буферный раствор. Скорость протекания буферного раствора при заполнении колонки должна быть ниже той скорости, которую устанавливают после нанесения препарата. Как только верхняя граница геля достигнет необходимого уровня, дополнительную трубку удаляют. Как до, так и после нанесения фракционируемого образца поверхность геля следует тщательно предохранять от повреждения. В длительных опытах постоянную скорость протекания элюента удобно поддерживать с помощью склянки Мариотта.

5. Краткое разъяснение некоторых терминов, используемых в литературе по гель-хроматографии.

V_t — общий объем столбика геля. (Рекомендуется определять общий объем геля, заполняя колонку водой и измеряя объем воды, а не с помощью вычислений, так как из-за неровностей стенки в последнем случае результат может быть не точен.)

V_о — внешний (свободный) объем, т. е. объем жидкости, заполняющей пространство между гранулами набухшего геля. (Его можно определить, хроматографируя на колонке вещество, не способное проникать в гранулы, например голубой декстран.)

V_x — объем набухшего геля в колонке (V_t — V_o).

V_t — внутренний объем, т. е. объем растворителя, который находится в порах набухшего геля.

V_e — объем элюата, т. е. объем элюирующего раствора, необходимый для элюирования данного вещества.

V_s — объем разделения, т. е. объем элюирующего раствора, равный разности объемов элюатов двух разделяемых гель-хроматографией веществ.

V_r — емкость по воде, т. е. максимальное количество воды (в мл), поглощаемой 1 г сухого геля.