Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Тонкослойная хроматография (Д. А. Медьеши)
Тонкослойная хроматография аминокислот и их производных
Для фракционирования аминокислот применяется хроматография в тонком слое силикагеля или целлюлозы. В отношении отдельных аминокислот для хроматографии на силикагеле характерна большая чувствительность, чем для хроматографии на целлюлозе, однако в тонком слое целлюлозы разделение лучше. В связи с этим ниже приводится метод Аркса и Неера [2] разделения аминокислот тонкослойной хроматографией на целлюлозе.
Приготовление слоя адсорбента. 8,0 г порошка целлюлозы MN 300 (фирма Macherey-Nagel, ФРГ) суспендируют в гомогенизаторе в смеси 48 мл дистиллированной воды и 2 мл этанола. Полученной суспензии достаточно для нанесения на 5 пластинок с толщиной слоя 0,25 мм. Пластинки с целлюлозой оставляют на ночь для подсушивания при комнатной температуре.
Для двумерного разделения используют 4 смеси растворителей, которые применяют в трех разных комбинациях: 1) н-бутиловый спирт — ацетон — диэтиламин — вода (10 : 10 : 2 : 5), 2) изопропанол — муравьиная кислота — вода (40 : 2 : 10), 3) втор-бутиловый спирт — 2-бутанон (метилэтилкетон) — дициклогексиламин — вода (10 : 10 : 2 : 5), 4) фенол — вода (75 : 25) в атмосфере 3%-ного NH4OH.
Растворитель (1) всегда применяют при разделении в первом, а любой из трех остальных растворителей — во втором направлении. Фракционирование проводят в обычной хроматографической камере, не выстилая ее стенок фильтровальной бумагой, смоченной растворителем. Растворитель наливают в камеру непосредственно перед опытом. Уровень растворителя должен быть на 15—20 мм ниже стартовой точки. Хроматографию продолжают до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет верхнего края пластинки. После этого пластинку высушивают 5—10 мин при 90°С или 12 ч при комнатной температуре. На втором этапе разделения рядом со стартовой точкой заносят стандартную смесь аминокислот и помещают пластинку в камеру со второй смесью растворителей. По окончании хроматографии пластинку 20 мин высушивают при 90°С.
Полученные хроматограммы рекомендуется проявлять нингидрин-коллидиновым реагентом (1,0 г нингидрина, растворенного в смеси 700 мл этанола, 29 мл 2,4,6-коллидина и 210 мл уксусной кислоты). При окрашивании этим реагентом можно обнаружить следующие минимальные количества аминокислот: 0,05 мкг для Ала, Асп и Вал; 0,1—0,2 мкг для Иле, Сер и Apr; 0,3—0,5 мкг для Гис, Лиз, Мет и Тир.
Найбом [13] на первом этапе разделения в тонком слое целлюлозы MN 300 проводил электрофорез в течение 15 мин в 0,7%-ной муравьиной кислоте при напряжении 400 В, а на втором — хроматографию в перпендикулярном направлении в смеси бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:2).