Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Ионообменная хроматография в фиксированном слое ионообменника
Нанесение проб

В классическом методе тонкослойной хроматографии перед нанесением на пластинку исследуемый материал необходимо обессолить. Обессоливание требует больших затрат труда и времени, а при малом количестве вещества приводит к значительным потерям. При ионообменной тонкослойной хроматографии соль, нанесенная вместе с образцом, не мешает Процессу разделения, так как концентрация элюирующего буферного раствора, как правило, превышает концентрацию солей в образце. Чтобы получить полное разделение фракций, необходимо выполнять следующие требования:

1. pH исследуемого образца должен быть ниже 3, целесообразно доводить его до 2. Если образец находится в сухом виде (например, высушенный гидролизат или экстракт), то. рекомендуется растворять его в 0,01 н. НСl.

2. Если исследуемый материал наносят в виде точки, ее диаметр не должен быть больше 2—3 мм, а если в виде полосы, то ширина ее не должна быть больше 1 см.

3. Образец наносят на пластинку с помощью тонкого капилляра. После каждого нанесения капли на пластинку место нанесения нужно подсушить, чтобы предотвратить повреждение слоя.

4. Чем выше концентрация наносимого образца, тем быстрее и удобнее проводить исследование. Максимально на пластинку следует наносить 1—2 мкг смеси аминокислот. При разделении смеси аминокислот с близкими значениями R_f для получения воспроизводимых результатов допустима 4—5-кратная разница в их концентрациях. Когда R_f аминокислот сильно различаются, это, конечно, не имеет значения.

5. Гидролизаты, если это необходимо (например, для определения Мет), можно непосредственно наносить на пластинку. В теплом потоке воздуха кислота мгновенно испаряется и Мет не успевает разложиться.

6. Щелочные гидролизаты, например при определении Три, наносят после нейтрализации или подкисления; образующаяся при этом соль не мешает хроматографии.

7. Если исследуемый материал растворяется в этаноле в присутствии кислоты, его суспендируют в растворе 0,1 н. НСl в 95%-ном этаноле, который осаждает следы белков, мешающих разделению. Для физиологических жидкостей (кровь, плазма и т. д.) такая обработка наносимого материала имеет большое значение.

8. Во всех до сих пор разработанных методиках ионообменной тонкослойной хроматографии ограничиваются одномерным разделением. Это одно из преимуществ данного метода по сравнению с классическими методами тонкослойной хроматографии. Для получения однозначной и простой для оценки картины следует в двух местах пластинки (в виде точки или полосы) нанести соответствующие контрольные смеси. Это очень облегчает идентификацию, а если по какой-то причине хроматографическая картина отличается от ожидаемой, тогда с помощью контрольной смеси можно выяснить причину неполного разделения и определить состав образца;