Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Анализ концевых групп и ступенчатая деградация белков и пептидов
Определение N-концевых групп 2,4-динитрофторбензольным методом
Гидролиз ДНФ-белка или ДНФ-пептида и экстракция ДНФ-производных
ДНФ-производное гидролизуют кислотой. Обычно в условиях эксперимента большая часть ДНФ-аминокислот не разрушается и их можно экстрагировать органическими растворителями в соответствии с растворимостью.
МЕТОДИКА
ДНФ-производное гидролизуют в 80-кратном избытке 6 н. НСl при 100° С 16 ч в ампуле, запаянной под вакуумом или в атмосфере азота. Гидролизат разбавляют в 3 раза дистиллированной водой и трижды экстрагируют свободным от перекиси эфиром. Эфирные фракции собирают и встряхивают 2—3 раза с дистиллированной водой для удаления следов кислоты, обезвоживают добавлением сухого Na2SO4, упаривают, а затем растворяют в нескольких каплях метанола и в 5—10 мл воды. Водную фазу освобождают от кислоты в вакууме и снова упаривают. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока полностью не удалят НСl. В заключение остаток растворяют в небольшом объеме воды.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. В описанных условиях ДНФ-Про разрушается полностью, а ДНФ-Гли — на 60—70%. ДНФ-Про еще можно определить, если вести гидролиз в 12 н. НСl в течение 4 ч. Для определения ДНФ-Гли гидролиз следует проводить в течение 3—4 ч в 6 н. НСl или же в смеси хлорной и уксусной кислот.
2. Описанная выше методика рекомендуется и для гидролиза ДНФ-пептидов.
3. Если в ходе анализа получается отрицательный результат, т. е. концевые группы обнаружить не удается, должны быть рассмотрены следующие возможные причины этого: 1) исследуемое вещество представляет собой циклическую молекулу и не имеет свободной а-NН2-группы; 2) молекула имеет малореакционноспособный (заблокированный) N-конец; 3) концевая группа ацетилирована (как, например, в цитохроме с или в белке вируса табачной мозаики); 4) и наконец, возможно, что ДНФ-производное (ДНФ-Про, ДНФ-Гли) разрушилось в ходе определения. Необходимо также учитывать, что выход ДНФ-Вал и ДНФ-Иле невелик из-за устойчивости к гидролизу пептидных связей Вал-Х и Иле-Х; в таких случаях следует проводить гидролиз в течение 72 ч.
4. Если концевым остатком является бис-ДНФ-Гис, то более удобно экстрагировать гидролизат этилацетатом, так как бис-ДНФ-Гис плохо растворим в эфире.
5. В эфире растворимы почти все концевые ДНФ-производные, а ε-NН2-ДНФ-Лиз, N-ДНФ-Гис, ДНФ-цистеиновая кислота (концевая) и а-ДНФ-Apr (концевой) растворяются также в воде.