Общая биотехнология: Курс лекций Часть II - Блинов В.А. 2004
Сельскохозяйственная биотехнология II
♦ Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов.
♦ Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов.
♦ Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов.
♦ Производство бактериальных удобрений и биодеградация пестицидов.
♦ Генетическая инженерия растений.
Урожайность сельскохозяйственных растений существенно зависит не только от неблагоприятных погодных и климатических условий, почвенной эрозии, наличия сорняков, грызунов, но и действия насекомых-вредитеней, нематод, фито патогенных грибов, бактерий, вирусов и др. Так, разрушительные последствия в картофелеводстве вызывает колорадский жук, а также гриб Phytophtora - возбудитель ранней гнили (фитофтороза) картофеля. Рост и развитие кукурузы практически полностью прекращает южная листовая гниль. Мозаичную болезнь табака и хлопчатника, зимнюю болезнь томатов и др. вызывают вирусы. Убытки сельского и лесного хозяйства от насекомых-вредителей оцениваются в мире в 100 млрд долларов ежегодно.
Биотехнологические пути защиты растений включают: 1) выведение сортов растений, устойчивых к неблагоприятным факторам; 2) разработку химических средств борьбы (пестициды) с сорняками (гербициды), грызунами (ратициды), фито патогенными грибами (фунгициды), бактериями и вирусами; 3) разработку биологических средств борьбы с вредителями. Установлено, что многие виды насекомых-вредителей (тля, колорадский жук, яблоневая плодожорка, озимая совка и др.) погибают под влиянием соответствующих энтомопатогенных препаратов.
В настоящее время производится более 30 микробиологических энтомопатогенных препаратов, изготовленных на основе патогенных бактерий, микроскопических грибов и вирусов. Они специфически поражают определенные виды насекомых и практически безвредны для человека, теплокровных животных, птиц и полезных насекомых. Препараты не вызывают нежелательных изменений в биоценозах и не нарушают экологию.
Отечественная промышленность выпускает гри группы энтомопатогенных препаратов:
♦ бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis; энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин;
♦ грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana;
♦ препараты на основе вирусов ядерного полиэдроза: вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и вирин-АББ.
Все микробные патогены выпускают в виде смачивающихся порошков или паст, реже гранул, инкапсулированных порошков, стабилизированной эмульсии спор и кристаллов.
Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов. Один из весьма эффективных микробов В. thuringiensis образует два токсина: ß и 5. ß-Эндотоксин обладает широким спектром действия на насекомых. Он представляет собой адениннуклеотид, конкурентно ингибирующий ферменты, которые катализируют гидролиз АТФ. Этот токсин является губительным для млекопитающих. Поэтому в производстве используют штаммы, которые не продуцируют ß- эндотоксин, а образуют 8-токсин. Он представляет собой белковый восьмигранник. При попадании в кишечник насекомых токсин растворяется в щелочной среде и частично гидролизуется протеазами. Такой модифицированный белок взаимодействует со стенкой кишки, в результате чего содержимое кишечного тракта попадает в кровоток насекомых. Гибель личинок наступает от септицемии. 5-Токсин безвреден для млекопитающих животных, человека, птиц.
Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов включает следующие стадии:
♦ проверку маточной культуры на отсутствие свободного фага, вирулентность, продуктивность спор и кристаллов;
♦ выращивание культуры в колбах до тигра спор не менее 1,7-109 в 1 мл;
♦ пересев культуры из колб в посевной аппарат (0,05 % на объем среды);
♦ введение посевною материала в основной ферментатор (вносят 0,0012 % инокулюма от объема среды в биореакторе).
Продолжительность выращивания в посевных и головных ферментаторах - 35-40 ч при 28-30 °С (исходное значение pH 6,3) до получения нужной плотности спор в 1 мл среды. В процессе культивирования среда защелачивается до pH 8,0-8,5, поэтому перед сепарированием, pH доводят до 6,0-6,2 подкислением. После сепарирования получают пасту (в среднем 100 кг из 1 м3 культуральной жидкости) с влажностью 85 % и содержанием спор 2-1010 в 1 г.
Готовый продукт представляет собой стойкую вязкую жидкость кремового или светло-серого цвета, без запаха Наполнителем служит кристаллическая микроцеллюлоза или каолин. Концентрация спор в препаратах 3-109/г. Коммерческие препараты представляют собой сумму спор и белковых кристаллов в клетках микроба-продуцента.
Энтобактерин предназначен для борьбы с насекомыми-вредителями садовых, огородных и парковых растений. Он эффективен в борьбе с более чем 60 видами насекомых. Основная масса вредителей погибает в течение 2-10 дней. Прибавка урожая от применения энтобактерина для овощных культур составляет 50 ц, а для садовых - 5 ц с 1 га.
Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов. По сравнению с энтомопатогенными бактериями и вирусами грибы обладают рядом особенностей:
♦ поражение происходит не через пищеварительный тракт, а непосредственно через кутикулу;
♦ насекомые поражаются в фазе развития куколки и имаго, что не встречается при взаимодействии с другими видами микроорганизмов;
♦ грибы характеризуются большой скоростью роста и огромной репродуктивной способностью; в виде спор в природных условиях длительно не снижают энтомопатогенную активность;
♦ грибам присуща высокая специфичность в поражении отдельных видов насекомых.
Спора гриба проникает в полость тела насекомого, где прорастает в гифу, затем она разрастается в мицелий, от которого отчленяются конидии. Они циркулируют в гемолимфе, выделяя токсины. Насекомое погибает вследствие нарушения циркуляции гемолимфы и от выделения грибом токсических веществ. Если токсина мало или он отсутствует, то мицелий заполняет все тело насекомого, в первую очередь мышечную ткань. Гибель насекомых наступает через 2-8 дней.
В России освоено промышленное получение энтомопатогенного препарата боверина методами глубинного и поверхностного культивирования на основе гриба рода Beauveria. Глубинное культивирование проводят в строго асептических условиях. Особенно важной стадией в технологии является получение посевного материала.
Исходный штамм, хранящийся на косяках агаризованного пивного сусла или среде Сабуро размножают при температуре 25- 28 °С в течение 3-43 суток культивированием в качалочных колбах на жидкой питательной среде. Полученные конидии-споры лиофильно высушивают; их можно хранить в течение 1 года. Посевной материал для засева питательной среды ферментатора получают путем размножения культуры сначала в колбах, потом в инокуляторе или сразу в инокуляторе. Для засева основного аппарата требуется посевной материал в количестве 2-10 % от объема питательной среды.
В состав питательной среды обычно входят (в %): дрожжи кормовые нелизированные - 2; крахмал - 1; хлорид натрия - 0,2; хлорид марганца - 0,01, хлорид кальция - 0,05. pH - 4,5- 5,6. Продолжительность культивирования спорового посевного материала составляет 25-28 ч при температуре 25-28 °С. Длительность культивирования в основном ферментаторе при той же температуре достигает 3 4 суток. Необходимо постоянное перемешивание среды и принудительная аэрация; количество воздуха достигает 2,5 объемов на объем среды в 1 мин. Оптимальная концентрация аминного азота - 10-15 мг/дл.
Готовую культуральную жидкость подвергают сепарации или фильтрации. После фильтрования получают пасту влажностью 70-80 %, которую направляют на распылительную сушилку. Высушенные споры - это мелко дисперсионный порошок влажностью 10%, имеющий титр до 8∙109 клеток в 1 г. Для определения LD50 порошок стандартизуют необходимым количеством каолина, иногда в качестве добавок вводят смачиватель и прилипатель.
Поверхностным культивированием получают спороносные пленки гриба. Однако этот способ получения боверина самый длительный и трудоемкий, поэтому используется реже других. Поверхностное культивирование гриба проводят как на жидкой питательной среде, так и полутвердой.
Различают три технологических приема производства боверина:
♦ культивирование гриба на жидких средах без автоклавирования, перемешивания и аэрации;
♦ культивирование на твердых и жидких автоклавированных средах без перемешивания и принудительной аэрации;
♦ комбинированный способ выращивания пленки гриба.
Остановимся лишь на наиболее производительном комбинированном/ способе выращивания пленки гриба. Он включает:
♦ получение маточных культур на зерне;
♦ выращивание инокулята (проращивание спор) в колбах на жидкой питательной среде в течение 12-17 ч;
♦ выращивание и накопление вегетативной культуры в ферментаторе с принудительной аэрацией и перемешиванием в течение 22-28 ч;
♦ розлив культуральной жидкости по кюветам и выращивание спороносных пленок;
♦ снятие, дозревание, сушка спороносных пленок;
♦ стандартизация препарата каолином.
Питательной средой для культивирования гриба является смесь, содержащая (в %): мелассу - 6; кукурузный экстракт - 1; сульфат магния — 0,05; фосфат калия однозамещенного - 0,2. Культивирование проводят при температуре 24-26 °С. На засев основного ферментатора берут 2-4 % инокулята от объема среды. Готовая культуральная жидкость имеет титр 50- 100 млн клеток в 1 мл.
Пленки выращивают в кюветах, помещенных в вертикальные камеры при температуре 25-26 °С. Весь производственный цикл занимает 11-12 суток, в т.ч. получение инокулята - 1 сутки; выращивание в ферментаторе — 1—1,5; выдерживание в шкафах (массовое образование конидий) - 5; дозревание пленок - 2; сушка пленок - 2-3 суток. Готовые пленки снимают и сушат при 28 °С в токе воздуха Высушенные пленки спор помещают в полиэтиленовые мешки и хранят в сухом месте при 18 20 °С.
Перед приготовлением боверина споровой материал размалывают в шаровой мельнице и просеивают через ряд сит. Готовый препарат (наполнитель каолин) должен иметь титр не ниже 1,5 млрд конидиоспор в 1 г.
Боверин применяют против листогрызущих вредителей сада, а также против яблоневой и восточной плодожорки, вредителей леса. Хороший эффект дает применение боверина против личинок колорадского жука на картофеле. С добавлением химических инсектицидов применение препарата приводит к 100 % гибели личинок всех возрастов. Норма расхода боверина 1-2 кг на 1 га.
Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов. Такие препараты обладают высокой специфичностью по отношению к насекомому-хозяину, поэтому они практически безвредны для человека, флоры и фауны. Вирусы весьма устойчивы к неблагоприятным воздействиям окружающей среды (температуре, влажности), они могут сохранять активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомого.
Заражение вирусом происходит при питании насекомого. В кишечнике при щелочных значениях pH освобождаются вирионы. Они проникают через стенку кишечника, а в ядрах восприимчивых клеток осуществляется их репликация. Это, в конечном счете, приводит к гибели личинок насекомого.
Производство любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина, так как вирусы могут размножаться только в живой ткани. Обычно на стадии гусеницы насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. Добиваются максимального накопления вируса в тканях насекомого. Через 7 9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают их при 33-35 °С, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь измельченных тканей фильтруют.
Технология каждого из вирусных энтомопатогенных препаратов имеет некоторые отличительные черты. Так, производство вирина-ЭКС предполагает осаждение полиэдров центрифигурованием. Титр 1 млрд полиэдров в 1 мл устанавливается простерилизованным глицерином и др. При производстве вирина-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания - ацетон в соотношении 4:1 к объему, в качестве наполнителя используют мелкодисперсный каолин или бентонит, титр полиэдров доводят до 1 млрд в 1 г и т. д.
Вирусные энтомопатогенные препараты либо вводят в плотные популяции насекомых, что вызывает в ней эпизоотию, либо опрыскивают или опыляют растения на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.
Как правило, комбинации нескольких биологических средств оказываются более эффективными, чем отдельно взятые препараты. Например, смертность соснового шелкопряда резко возрастает, если вирус цитоплазматического полиэдроза применяют в сочетании с препаратами из В. thuringiensis.
Средства защиты растений от фито патогенных микроорганизмов можно классифицировать как:
♦ антибиотики. Так, триходермин и трихотецин, продуцируемые грибами Trichoderma sp. и Trichotecium roseum используются для борьбы с корневыми гнилями овощных, зерновых и технических культур;
♦ фитоалексины. Они синтезируются в тканях растений в ответ на внедрение фитопатогенов и могут служить высокоспецифичными заменителями пестицидов. Например, фитоалексин перца успешно применяют при фитофторозе;
♦ микробы-антагонисты, вытесняющие патогенный вид и подавляющие его развитие;
♦ вакцинные и иммунологические препараты, которые вводятся непосредственно в прорастающие семена;
♦ d-фактор, специфический агент, снижающий жизнеспособность возбудителя.
Итак, биологические средства - важная часть комплексной программы защиты растений от различных фитопатогенных микроорганизмов.
Производство бактериальных удобрений и биодеградация пестицидов. В настоящее время очевидно, что альтернативой химизации сельского хозяйства являются естественные, биологические технологии. Они включают в себя биологические методы защиты растений, селекцию устойчивых сортов, использование современных систем агрохимических мероприятий и др. В этом отношении особенно перспективно использование в сельском хозяйстве специфических микробных популяций. Многие из них известны сравнительно давно и применяются для борьбы с вредителями, подавления роста и развития сорняков, при производстве силоса, они эффективны в животноводстве и птицеводстве или являются альтернативой азотным удобрениям. Подробно о микробных почвоудобрительных препаратах можно прочитать в книге В. А. Блинова «Биотехнология» (2003). Здесь приведем лишь технологию производства ризотрофина.
Разотрофин представляет собой торфяную основу, смешанную с ризобактериями (5-8-109 клеток в 1 г торфа). Технологический процесс производства ризотрофина включает подготовку клубеньковых бактерий и получение инокулята, подготовку торфа, «обсеменение» торфа ризобактериями. Питательные среды обычно достаточно простые. Они содержат растительные экстракты или отвары, сахарозу, глюкозу и маннит.
Инокулюм готовят в условиях умеренной аэрации на подобных средах, вводя дополнительно фосфаты, сульфаты, карбонаты (температура 28-30 °С); необходимо пеногашение. Накапливают примерно 5 млрд клеток в I мл. Такую суспензию вносят в «кислый» торф (pH 3,0-6,0) при 10-15 °С. Торф должен быть гомогенным, подсушенным, размолотым, смешанным с мелом и простерилизованным радиацией — 2,5 Мрад. В подготовленный торф вводят суспензию бактерий так, чтобы в 1 г содержалось 0,5-1 млрд клеток и тщательно перемешивают. Продукт может храниться до полугола при 5- 10 °С для быстро растущих ризобактерий и при 12-15 °С для медленно растущих. Расход ризотрофина составляет 200 г на 1 га для семян любых бобовых растений.
К микробным стимуляторам и регуляторам роста растений относится фузикокцин. Эго вещество гормонального типа. Под его влиянием усиливается корнеобразование у многих древесных и плодоовощных культур, стимулируется прорастание семян моркови, томатов, сахарной свеклы и др.
Фузикокцин образуется грибом Fusicoccus amygdali. Продукт получают при глубинной ферментации в периодическом режиме на средах с глюкозой или сахарозой и соевой мукой. Фузикокцин затем экстрагируют бутилацетатом или хлороформом из культуральной жидкости, сорбируют активированным углем, повторно очищают и кристаллизуют из этилацетата.
Другим регулятором роста растений является гибберелловая кислота. Она синтезируется микромицетом Gibberella fujkuroi и относится к группе растительных гормонов сложного химического строения. Биосинтез гибберелловой кислоты происходит через ацетил-КоА, мевалоновую кислоту и циклизованные структуры. При поверхностном культивировании продуцента биосинтез гибберелловой кислоты занимает около 15 суток при 25 °С и до 9-10 суток при глубинной ферментации. Питательные среды для продуцента сложные. Они содержат 4-6 % глюкозы, сахарозы или глицерина, 0,7 % солей аммония, цитрата или пептона, 0,3 % неорганического фосфата, 0,05 % сульфата магния, разные микроэлементы, pH среды доводят соляной кислотой до 3,0-4,0. При этом выход гиббереллинов достигает 200 мг/л культуральной жидкости (поверхностный способ) или 1 г/л при глубинном культивировании в ферментаторах. Получают суммарный препарат гибберелловой кислоты из вакуум-упаренной культуральной жидкости после отделения мицелия продуцента. Гибберелловую кислоту применяют в качестве стимулятора роста различных растений с максимальным эффектом в дозе 1 мкг на растение.
Биодеградация пестицидов очень важная проблема. Пестициды обладают сильным, но недостаточно избирательным действием. Они могут наносить существенный ущерб сельскохозяйственным культурам и длительно сохраняться в почве. Для решения этих проблем совершенствуют технологию применения пестицидов, выводят растения, устойчивые к пестицидам или инициируют биодеградацию пестицидов в почве. Устойчивость того или иного пестицида может изменяться при добавлении его в сочетании с другим ядохимикатом. Методами генетической инженерии сконструированы штаммы микроорганизмов с повышенной эффективностью биодеградации ядохимикатов. Так, штамм Pseudomonas ceparia разрушает 2,4,5-трихлорфеноксиацетат.
Биодеградация пестицидов, естественно, уменьшает их полезный эффект. Кроме того, при биодеградации могут образовываться промежуточные продукты, сильно ядовитые для растений. Например, при использовании гербицида тиобенкарба наблюдается подавление роста и развития риса. Этот ингибирующий эффект оказывает не сам гербицид, а его дехлорированное производное 3-бензил-N,N-диэтилтиокарбамат. Чтобы этого не происходило, тиобенкарб применяют в комбинации с метоксифеном, который ингибирует дехлорирующий фермент микроорганизмов.
Генетическая инженерия растений. Селекция на основе гибридизации, спонтанных и индуцированных мутаций позволяет получить большое число сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Методы генетической и клеточной инженерии решают задачи по повышению устойчивости новых форм, линий, сортов и гибридов сельскохозяйственных растений к патогенам и сокращению продолжительности выведения новых сортов.
В генетической инженерии растений выделяют следующие основные этапы получения трансгенных растений: 1) выбор гена и его клонирование; 2) подбор генотипа растения- реципиента; 3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента; 4) регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений.
Получение трансгенных растений стало возможным после того, как была установлена трансформирующая активность Ti-плазмид почвенных агробактерий. Это кольцевые молекулы ДНК длиной ≈ 200 т.н.п. Чаще всего встречаются Ti-плазмиды, кодирующие аминокислоты нопалин и октопин. Нуклеотидные последовательности Ti-плазмид делят на две группы: 1) необходимые для метаболизма самой агробактерии; 2) необходимые для трансформации растительной клетки.
Установлено, что агробактерии и Тi-плазмиды не входят в растительную клетку, но часть плазмиды может переноситься в ядро такой клетки и встраиваться в ее геном. Этот фрагмент Ti-плазмиды был назван T-ДНК (англ. Transforming DNA - трансформирующая ДНК). T-ДНК в геноме изменяет гормональный статус растительной клетки, что приводит к ее де- дифференцировке и опухолеобразованию. Для трансформации клеток, кроме того, необходима другая область Ti-плазмиды (vir-область; область вирулентности), которая переносит T-ДНК в геном растения.
В настоящее время на основе Ti-плазмиды получены следующие векторы для трансформации растений.
Коинтегративный вектор. Он облегчает введение чужеродной ДНК в геном растений. Для получения коинтегративного вектора используют векторы на основе плазмиды Е. coli. В эти векторы вставляют фрагмент T-ДНК и ген селективного маркёра (обычно ген, кодирующий устойчивость к канамицину, гигромицину или гербициду), который в последующем позволяет отбирать трансгенные растения. Кроме того, используют другой вектор (A. tumefaciens), несущий гены, необходимые для интеграции области T-ДНК в геном растения. Этот вектор содержит vir-область. Таким образом, коинтегративный вектор получается в результате рекомбинации между двумя плазмидами.
Бинарный вектор. Техника получения такого вектора более проста. Смысл ее заключается в том, что в агробактериальной клетке находят плазмиды, содержащие область пограничных повторов Г-ДНК и vir-область. Их интегрируют в одном векторе, вводят в агробактерии, а затем и растительные клетки.
Для трансформации растительных клеток используют также векторы на основе Ri-плазмид, ДНК-содержащих вирусов растений, на основе мобильных элементов (транспозонов) - это последовательности ДНК, имеющие специфическое строение и способные к транспозициям по геному.
К современным методам трансформации растительных клеток относят:
♦ метод кокультивирования с агробактерией. Основан на трансформации растительных эксплантов агробактериями, которые несут векторы, содержащие чужеродные гены, встроенные в T-ДНК;
♦ методы прямого переноса генов в растение. Используют следующие методы переноса ДHК -векторов в протопластные клетки: микроинъекции ДНК, электропорацию (увеличение проницаемости биомембран высоковольтным импульсом — 200-350 В, длительность импульса 54 мс), упаковку в липосомы, биобаллистическую трансформацию (на частицы вольфрама, платины или золота размером 0,6-1,2 мкм напыляется ДНК-вектора). Частицы помещаются в биобаллистическую пушку, в которой давление уменьшается до 0,1 атм. При сбрасывании давления частицы с большой скоростью устремляются на суспензию клеток, разрывают их клеточные стенки, входя в цитоплазму и ядро клеток. Те клетки, которые находятся в зоне 0,6-1 см от центра действия пушки, оказываются трансформированными. Их переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.
Для экспрессии (функционирования) чужеродных генов в геноме растений наиболее часто используют промотор 35S-РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Такой промотор способен экспрессировать бактериальные гены в эукариотической (растительной) клетке. В последнее время широко применяют тканеспецифические промоторы растительных генов. Отличие состоит в том, что гены под их контролем экспресс ируются только в определенных тканях. Например, ген, контролируемый пататиновым промотором, будет экспрессироваться только в клубнях картофеля, так как белок пататин является белкой именно клубней картофеля. Другой пример: нередко необходимо защитить от почвенных патогенов только подземные части растений. В этом случае предпочтительнее использовать корнеспецифический промотор. Используют также индуцибельные промоторы. Гены под такими промоторами экспрессируются не постоянно, а лишь в определенных условиях.
Для выявления экспрессии чужеродных генов используют маркеры экспрессии - репортерные гены. Они кодируют какой-либо фермент, продукт реакции которого можно легко детектировать, либо образуют флюоресцирующий белок, который легко идентифицировать.
Методы генетической инженерии позволяют существенно улучшить качество и повысить продуктивность растений. Так, генноинженерньм путем получены высоколизиновые сорта ячменя, кукурузы, пшеницы. Уже получены растения табака и картофеля, синтезирующие иммуноглобулин А-G, энтеротоксин, Д-токсин холеры, белок поверхностного антигена гепатита В. Причем белок, полученный из трансгенных растений, обладал такими же антигенами и физиологическими свойствами, как и белок, полученный из исходных клеток.
Проводятся работы по генноинженерному улучшению состава жирных кислот ряда масличных культур, и в первую очередь рапса. Активно проводятся генно-инженерные работы по увеличению фотосиытетической активности растений и увеличению синтеза отдельных веществ. С 1999 г. в США, Канаде и ряде других стран, где разрешено использование трансгенных растений, уже применяется в сельскохозяйственном производстве семь транс генных сортов кукурузы и один сорт пшеницы, имеющие высокую урожайность и качество продукции.
Биотехнологические подходы позволяют получать трансгенные растения, устойчивые к стрессовым воздействиям (засуха, избыточное увлажнение, воздействие высоких и низких температур, засоление, кислотность почв и др.), толерантных к насекомым-вредителям, устойчивых к грибной, бактериальной и вирусной инфекции, к различным гербицидам и т.д. Так, в странах Северной Америки и Европы разрешены к применению более 20 сортов трансгенных растений, устойчивых к гербицидам: кукуруза, хлопок, рис, соя, пшеница, картофель, томаты, лен. Проходят полевые испытания трансгенные сорта клубники, сахарной свеклы и некоторых цветочных культур. Всего к 2001 г. в странах, где разрешено использование генетически модифицированных растений, возделывается 78 сортов трансгенных растений.
Вместе с тем нерешенных проблем генной инженерии растений еще немало. Так, одна из проблем связана с трудностью одновременного введения в гены растений больших (более 10 т.н.п.) генов или нескольких функциональных генов. Это связано, в первую очередь, с офаниченной емкостью векторов для трансформации. Другая проблема обусловлена тем, что часто после двух-пяти поколений активно транскрибирующийся трансген перестает экспрессироваться. Активизировать такой «выключенный» трансген пока невозможно. Кроме того, недостаточно исследований по идентификации эффективных генов, созданию банков генов и весьма ограничена научная база генетической инженерии, что связано со слабой финансовой поддержкой биоинженерии.