Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Общая биотехнология
Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве
Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств

С одной стороны, структура многих лекарственных препаратов включает модификации отдельных аминокислот. С другой стороны, эти препараты можно рассматривать как производные пуринов и пиримидинов, т. е. азотистых оснований нуклеиновых кислот.

Все чаще в биотехнологическом производстве используются сконструированные методами генетической инженерии микроорганизмы — рекомбинанты, продуцирующие видоспецифические для человека белки, играющие роль биорегуляторов, факторов неспецифического иммунитета и т.д.

Поэтому при биосинтезе вышеперечисленных лекарственных препаратов биотехнологу приходится учитывать явление так называемого строгого аминокислотного контроля метаболизма клетки и уметь использовать его в своих целях.

Строгий аминокислотный контроль метаболизма клетки позволяет ей быстро приспосабливаться к меняющимся внешним условиям: или выживать, или не только выживать, но и быстро размножаться (накапливать биомассу культуры). Строгий аминокислотный контроль осуществляется с участием рибосомы, но уже не как «машины» для синтеза белка, а как своеобразной «сенсорной органеллы» и многофункционального биорегулятора гуанозин-тетрафосфата, играющего здесь ключевую роль. В молекуле этого, образно говоря, «перефосфорилированного» гуанозина два гидроксила в рибозе: 5-ОН и 3-ОН замещены дифосфатными остатками.

Гуанозин-тетрафосфат выполняет принципиальную роль при переключении метаболизма клетки, переносимой, например, с бедной питательной среды на богатую, и наоборот.

Перенос клеток с бедной среды на богатую обеспечивает быстрый рост культуры и быстрое накопление ее биомассы, а перенос клеток с богатой среды на бедную приводит к условиям, когда не может поддерживаться ни быстрое размножение культуры, ни накопление биомассы. На биохимическом уровне при замене бедной среды богатой в клетках уже за несколько минут резко усиливается синтез рибосомальной РНК, формируются рибосомы и после этого возрастает суммарный синтез белка. Растет биомасса, начинается быстрое деление клеток. С биологической точки зрения это целесообразно, так как соблюдается нормальный баланс макромолекул.

При переносе клеток с богатой среды на бедную сразу же резко сокращается синтез РНК. Прекращается образование рибосом, а затем и синтез белка. Клетка как бы «застывает» в покоящемся, но при этом жизнеспособном состоянии и относительно благополучно переносит условия голодания: баланс макромолекул сохраняется на таком уровне, при котором хаотических нарушений метаболизма не происходит. Это обеспечивается именно за счет механизма строгого аминокислотного контроля. На бедной среде в рибосомно-матричную систему поступают молекулы не аминоацил тРНК, а «пустые» или не загруженные молекулы тРНК, поскольку среда бедная и аминокислот во внутриклеточном фонде клетки начинает не хватать. «Пустые» молекулы тРНК реагируют с акцепторным местом, однако синтеза полипептидной цепи не происходит, и синтез белка прерывается.

У нормальных, так называемых Rel⁺-клеток (имеющих ген rei А), происходит превращение рибосомы в сенсорную органеллу, т.е. активируется ассоциированный с рибосомой белковый (продукт гена rei А) фактор строгого «контроля», который является пирофосфат-трансферазой.

Как отмечалось, гуанозин-тетрафосфат может функционировать как биорегулятор. Установлено, что он связывается с РНК-полимеразой и при этом, что принципиально важно, по-разному изменяет ее сродство к промоторам различных генов. Экспрессия одних генов усиливается, других — подавляется. Подавляются гены, включенные в синтез рибосомной РНК, и как следствие — резко падает количество РНК в клетке на бедной среде, а затем и количество белков. Наряду с «негативным» гуанозин-тетрафосфат способен и к «позитивному» контролю, в рамках которого активируются, в частности, триптофановый, гистидиновый, треониновый опероны: клетки под влиянием голодания по аминокислотам, используя гуанозин-тетрафосфат, мобилизуют свои возможности синтеза аминокислот. Биотехнолог обязательно должен учитывать это обстоятельство при получении лекарственных агентов на основе аминокислот.

Помимо падения синтеза РНК под влиянием гуанозин-тетрафосфата подавляется активность некоторых ферментов, участвующих в синтезе нуклеотидов, а также в транспорте нуклеотидов в клетку. При этом в клетке не только не образуется рибосомальная РНК, но уменьшается и содержание ее предшественников. Иначе говоря, происходит координированное многостороннее изменение клеточного метаболизма, которое имеет приспособительный характер. Поэтому роль гуанозин-тетрафосфата в Rel⁺-клетках, которые биотехнолог стремится сделать сверхпродуцентами аминокислот, становится еще более «позитивной».

Если целью биотехнолога является наработка нуклеотидов (пуринов и пиримидинов), производными которых являются многие лекарственные агенты, например, противоопухолевые антибиотики, то роль гуанозин-тетрафосфата должна рассматриваться в целом как негативная. В данном случае одним из подходов к решению этого вопроса может быть получение Rеl⁺-клеток продуцента с уменьшенным количеством фактора строгого аминокислотного контроля или полным его отсутствием.

При конструировании микробных продуцентов чужеродного белка также необходимо учитывать роль гуанозин-тетрафосфата. Целевой белок должен быть стабилен и не подвергаться в клетке действию протеолитических ферментов, активность которых должна быть ограничена. Если же целевым продуктом является циклопептид и тем более если часть его аминокислотных остатков находится в D-форме, как, например, у широко известного иммунодепрессанта циклоспорина А, опасность внутриклеточного протеолитического расщепления резко падает и в этом случае большое значение будет иметь «позитивный» эффект гуанозин-тетрафосфата — активация оперонов некоторых аминокислот.

Естественно, чтобы использовать механизмы внутриклеточной регуляции для производственных целей, необходимо знать их действие на генетическом, биохимическом и физиологическом уровнях. Необходимо также знание видовых особенностей продуцента и особенностей его штамма. Но даже при наличии последних прогнозировать конечный результат при вмешательстве в регуляционные процессы, учитывая их многочисленность и взаимозависимость, очень и очень сложно. Поэтому, несмотря на быстрые успехи фундаментальных наук, подбор сред и условий ферментации все еще нередко носит эмпирический характер.