Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Общая биотехнология
Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве
Транспорт веществ через мембранные структуры клетки и его регуляция

Наиболее общим компонентом клеточной оболочки, присущим клеткам микроорганизмов, растений и животных, является цитоплазматическая мембрана — двухслойная фосфолипидная субклеточная структура с включенными в нее разнообразными по функциям белками. У микроорганизмов (как и у растений) над цитоплазматической мембраной клетки располагается клеточная стенка, представляющая жесткий полимер, состоящий у высших растений из целлюлозы, у эубактерий и актиномицетов из пептидогликана, а у грибов из слоев хитина, глюкана и маннопротеина (т.е. из разных полимеров).

У грамотрицательных бактерий помимо цитоплазматической мембраны имеется и другая мембрана, называемая внешней, так как она располагается над клеточной стенкой. Внешняя мембрана имеет иную структуру, чем цитоплазматическая, которую в случае наличия внешней мембраны называют внутренней. Внешняя мембрана асимметрична, ее наружная поверхность, обращенная в среду, состоит в основном из липополисахаридов, молекулы которых координируются ионами магния; поверхность, обращенная к клеточной стенке, состоит из фосфолипидов. Внешнюю мембрану пересекают белки-порины. Их тримеры формируют через нее сквозные водные каналы.

Пространство между внешней и внутренней мембранами, в котором находится клеточная стенка, имеет структуру геля и называется периплазматическим.

Животные клетки имеют только цитоплазматическую мембрану. Так как цитоплазматическая мембрана присуща всем клеткам, то из этого следует, что системы регуляции транспорта из среды в клетку необходимых клетке веществ и системы выброса ненужных веществ из клетки в среду обязательно связаны с цитоплазматической мембраной. Клеточная стенка не играет существенной роли ни в транспорте низкомолекулярных метаболитов, ни в регуляции этого процесса. Однако внешняя мембрана грамотрицательных бактерий и, особенно, периплазматическое пространство содержат ряд ферментов, участвующих в процессах транспорта низкомолекулярных соединений.

Процессы транспорта через клеточную оболочку подразделяют на пассивную диффузию, облегченную диффузию и активный транспорт.

При пассивной диффузии, т.е. в соответствии с градиентом концентрации, когда в среде концентрация выше, чем внутри клетки, в клетку проникают вода, углеводороды, молекулы кислорода, азота, водорода.

В случае облегченной диффузии необходимые клетке вещества переносятся из среды в клетку с помощью пермеаз — особого класса белков, содержащихся в мембране. Переносимое вещество реагирует с пермеазой на наружной стороне мембраны и освобождается после переноса через мембрану внутри клетки. При облегченной диффузии проникающее в клетку вещество продвигается по градиенту концентрации. Затрат энергии на этот процесс не требуется, как и при пассивной диффузии.

При активном транспорте вещества в клетку, требующем затраты энергии, движение переносимого вещества может происходить против градиента концентрации. При этом концентрация накапливающегося в клетке соединения может превзойти в сотни и тысячи раз его концентрацию в среде в связи с тем, что когда мембранный переносчик обращен к наружной поверхности мембраны, он высокоспецифичен к переносимому им субстрату, когда же он обращен внутрь клетки, сродство резко снижается в результате диссоциации субстрата и переносчика. Если энергодающие реакции блокируются, например ферментными ядами, реагирующими с функциональными группами белковой части ферментов, то активный транспорт в клетку низкомолекулярных веществ прекращается.

Источником энергии для активного транспорта очень часто является трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода. Переносчики, имеющие места связывания протонов и молекул субстрата, используют мембранный потенциал для переноса внутрь клетки ионов водорода и питательных веществ. Переносчик, связавшись с протоном, повышает свое сродство к субстрату. Освободившись от протона на поверхности мембраны, обращенной внутрь клетки, переносчик снижает сродство к субстрату. Таким образом, фактически здесь происходит перенос двух субстратов в одном направлении. Подобного рода транспорт получил название «симпорт». Если переносчик осуществляет перенос только одного субстрата, используется термин «унипорт». Наконец, механизм транспорта одним и тем же переносчиком двух субстратов, но в противоположных направлениях, именуется «антипорт».

АТФ-зависимые системы активного транспорта используют энергию АТФ. В такие системы входят расположенные в периплазматическом пространстве белки с высоким сродством к ряду метаболитов, принадлежащим к пептидам, аминокислотам, сахарам и др. Они препятствуют выходу в среду ряда метаболитов из цитоплазмы. С их помощью в периплазматическом пространстве накапливаются определенные питательные соединения из среды.

Говоря об активном транспорте веществ в клетку, нельзя не упомянуть о системах транслокации (переноса) групп. Их функционирование приводит к транспорту в клетку, например, углеводов в виде фосфатных эфиров, а внутриклеточная концентрация оказывается гораздо выше, чем в среде.

Фосфотрансферазы, участвующие в работе таких систем, инициируют и ряд других реакций в клетке. Вообще транспорт многих субстратов в клетку подвержен регуляции на уровне как биосинтеза компонентов этих систем, так и функциональной активности уже синтезированных компонентов.

Самостоятельный интерес представляет выведение из клетки избыточных продуктов метаболизма, в частности защитных ферментов, антибиотиков и экзоферментов, позволяющих утилизировать находящиеся в среде полимеры. Низкомолекулярные вещества могут выводиться путем пассивной или облегченной диффузии. Однако существуют и энергозависимые системы. Особый интерес у биотехнологов, в том числе работающих в области получения рекомбинантных белков, вызывает проблема выведения из клетки белка, синтезируемого в цитоплазме, включая чужеродный белок, являющийся целевым продуктом. В данном случае биотехнолог идет по пути повторения выработанного эволюцией механизма секреции таких белков, как внеклеточные ферменты.

Когда синтезируется такого рода белок, которому предстоит пересечь цитоплазматическую мембрану и выйти из клетки в среду, то, во-первых, его синтез происходит на рибосомах, связанных с обращенной в цитоплазму поверхностью цитоплазматической мембраны, во-вторых, покидающая рибосому полипептидная цепь на своем N-терминальном конце содержит сигнальный или лидерный пептид (15 — 30 аминокислотных остатков). Этот дополнительный участок в полипептидной цепи временно нужен для выведения внеклеточного белка из клетки и имеет свои особенности:

✵ конечный аминокислотный остаток, положительно заряженный (облегчается взаимодействие с поверхностью мембраны, имеющей отрицательный заряд);

✵ протяженный участок гидрофобных аминокислотных остатков, облегчающий прохождение через липидные слои мембраны;

✵ наличие специфичного участка для действия так называемой сигнальной протеазы (или пептидазы) — мембранного фермента, катализирующего отщепление лидерного пептида от основной полипептидной цепи после выполнения функции своеобразного проводника новой белковой молекулы из клетки в среду.

Таким образом, рекомбинантный белок, например, видоспецифичный белковый гормон человека, синтезируемый в цитоплазме микробной клетки и не имеющий специфической лидерной последовательности, можно с помощью методов генетической инженерии снабдить лидерной последовательностью с условием, чтобы она могла быть субстратом для микробной сигнальной пептидазы. Отсюда следует проблема создания гибридных (химерных) белков с лидерной последовательностью, принадлежащей, например, к внешнеклеточной пенициллиназе.

Разумеется, проблема выведения чужеродных белков не решается однозначно и только за счет присоединения лидерной последовательности, так как существует много других факторов, влияющих на экскрецию белков.

В заключение этого краткого рассмотрения проблем транспорта веществ в клетку и из клетки обратим особое внимание на мутации, которые могут затрагивать ферментные системы транспорта, молекулы переносчиков, структурные компоненты цитоплазматической и внешней мембран, что дает биотехнологу богатый набор мутантов с самыми разнообразными изменениями физиологических и биохимических свойств.

Особенности транспортных систем у некоторых биообъектов определяют их способность воздействовать на окружающую среду в нужном для человека аспекте.

Например, ряд представителей микроорганизмов рода Pseudomonas и целенаправленно полученных от природных культур мутантов обезвреживают самые разнообразные химические соединения (кольчатые углеводороды и др.), попадание которых в окружающую среду приводит к нарушению экологии в обширных географических регионах. Причем способность вышеуказанных микроорганизмов обезвреживать загрязнения обусловлена не только набором ферментов, утилизирующих экзотические вещества, но и особенностями транспортных систем, начиная с режима осцилляции пориновых каналов внешней мембраны.