Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989

Молекулярная генетика и системы регуляции
Модификация структуры клеточной ДНК
Слияние клеток

Глубокие генетические изменения, включающие кроссинговер генетического материала различных видов, могут быть достигнуты путем слияния клеток разных типов. Как показано на схеме слияния клеток микроорганизмов (рис. 6.17), первой стадней этого сложного процесса является получение протопластов — клеток, лишенных наружных стенок и окруженных только плазматическими мембранами. Для этой цели применяют различные ферменты (гидролазы клеточных стенок), а процесс гидролиза проводят в строго гипотонической среде, чтобы свести к минимуму разрушение протопластов под влиянием осмотического давления. Инкубирование протопластов приводит к регенерации клеточных стенок и восстановлению нормальной клеточной морфологии. Это обстоятельство играет решающую роль во всем процессе, поскольку в результате слияния протопластов различных штаммов нам, очевидно, необходимо в конце концов получить организм, который можно было бы далее культивировать в обычных условиях, в том числе и в крупномасштабном промышленном производстве. Слияние протопластов обычно осуществляют в растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ), который индуцирует этот процесс, а для выделения продуктов слияния протопластов применяют методы селекции, аналогичные использующимся в традиционной генетике микроорганизмов (табл. 6.3).

РИС. 6.16. Генетическая карта Е. coli K12, на которой показаны относительные положения различных генов в кольцевой хромосоме. [Воспроизведено из статьи: Taylor A. L., Trotter С. D., Revised Linkage Map of E. coli, Bacteriol. Rev., 31, 332 (1967).]

РИС. 6.17. Основные этапы работы по получению и выделению новых штаммов путем слияния протопластов двух различных исходных штаммов. [Воспроизведено из статьи: Peberdy J. F., Protoplast Fusion — A Tool for Genetic Manipulation and Breeding in Industrial Microorganisms Enzyme Microb Technol., 2, 25 (1980).]

Описанным путем успешно получали гибридные клетки различных штаммов Penicillium, Aspergillus, Streptomyces, Cephalosporium, дрожжей и бактерий. Межвидовые гибриды получены, в частности, между различными видами Penicillium, Aspergillus, между Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces diastaticus, между Candida tropicalis и Saccharomyces fibuligera. Гибриды существенно различающихся видов недостаточно стабильны и через несколько поколений часто превращаются в один из родительских видов, однако в делом метод слияния протопластов представляет собой очень интересный способ существенной перестройки генетического материала клетки в одну стадию. В настоящее время проводится изучение возможности слияния протопластов быстро растущих штаммов Streptomyces с мутантными высокопродуктивными, но медленно растущими штаммами.

Метод слияния клеток может применяться и для получения гибридов клеток растительных или животных организмов. Примером могут служить имеющие уже сейчас большое практическое значение и очень перспективные гибридомы, образующиеся при слиянии продуцирующих антитела клеток лейкоцитов с клетками миеломы (рака кожи) мыши или другого животного. Каждая гибридомная клетка синтезирует только один тип антител, поэтому полученная из одной гибридомы культура клеток продуцирует моноклональные антитела. Напротив, если антитела получают путем введения в организм, например кролика, белка или другого антигена, то этот организм одновременно синтезирует множество антител, специфичных в отношении различных участков молекулы антигена. Моноклональные антитела уже в настоящее время представляют собой важный инструмент исследования и служат основой для применяемых сейчас или разрабатываемых многочисленных методов диагностирования заболеваний. В иммобилизованной форме моноклональные антитела являются чрезвычайно специфичными аффинными адсорбентами, пригодными для выделения и очистки антигенов в лабораторных и промышленных масштабах. В перспективе моноклональные антитела могут оказаться очень ценными агентами для интроскопии опухолей и транспорта лекарственных препаратов к определенным типам клеток организма.

Небольшие количества моноклональных антител удобно получать путем инокуляции гибридомных клеток в брюшную полость иммунологически совместимой мыши. Развивающаяся опухоль выделяет моноклональные антитела в окружающие опухоль жидкости организма; концентрация антител в последних достигает 1—20 мг/мл. Гибридомы можно выращивать и в культуре. В настоящее время большое внимание уделяется разработке и внедрению в производство новых конструкций реакторов, позволяющих повысить плотность клеток и их продуктивность в отношении антител, а также поиску путей снижения стоимости моноклональных антител при их крупномасштабном производстве.