Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989
Молекулярная генетика и системы регуляции
Технология рекомбинантных ДНК
В конце 70-х годов в биохимии был разработан ряд новых методологических подходов, ознаменовавших начало эры генетической инженерии. Методы рекомбинантных ДНК, перевернувшие наши представления о возможностях биотехнологии в сфере удовлетворения потребностей человека, позволяют направленно конструировать генетический материал, вводить его в живые клетки и с помощью последних реализовать эту генетическую информацию. Кроме того, благодаря технологии рекомбинантных ДНК значительно ускорились темпы расширения и развития наших знаний о функциях ДНК, организации генов, регуляции их экспрессии, первичной структуре белков, что в свою очередь создает основу для понимания природы различных заболеваний и борьбы с ними. Возможность введения любых сегментов ДНК в клетки позволяет создавать промышленные микроорганизмы, способные синтезировать ценнейшие белки. В этом разделе мы уделим основное внимание применению генетической инженерии в промышленности и использованию в качестве организма-хозяина бактерии Escherichia coli.
Прежде чем перейти к изучению основных приемов и методов генетической инженерии, целесообразно рассмотреть общие принципы процесса и познакомиться со специальной терминологией. На рис. 6.21 изображена упрощенная схема клонирования фрагмента ДНК. Под клонированием здесь мы понимаем приготовление колонии генетически идентичных клеток, которые содержат интересующий нас сегмент ДНК. Этот сегмент, названный на рис. 6.21 «чужеродной ДНК», получают путем разрезания большого участка ДНК на фрагменты с помощью специфичных эндонуклеазных ферментов или путем синтеза — химического или ферментативного. Чужеродную ДНК соединяют (in vitro) с вектором — специальным инструментом для введения чужеродной ДНК в бактериальную клетку. В нашем примере вектор представляет собой бактериальную плазмиду, несколько модифицированную с целью облегчения процесса клонирования. Затем молекулу рекомбинантной ДНК (комплекса чужеродной ДНК с плазмидой) вводят в ДНК клетки бактерии, используя механизм трансформации. После этого с помощью описанных ниже методов идентифицируют клон, содержащий плазмиду с чужеродной ДНК.
РИС. 6.21. Основные этапы клонирования фрагментов чужеродной ДНК.
Клонирование фрагмента ДНК дает возможность получить его в количествах, достаточных для детального изучения и применения в качестве реагента в последующих биохимических и генетических работах. В качестве примера использования клонированных ДНК для аналитических целей можно указать на ход работ по изучению интерферона из фибробластов (IFN-ß) в конце 70-х годов. Этот белок был чрезвычайно труднодоступен, поэтому даже с помощью самых чувствительных приборов для определения аминокислотной последовательности удавалось выяснить природу только нескольких N-концевых аминокислотных остатков белка. Однако вскоре после клонирования гена интерферона из фибробластов была определена его нуклеотидная последовательность, из которой с учетом генетического кода непосредственно вытекала и аминокислотная последовательность соответствующего белка! В разд. 6.4.4 мы рассмотрим примеры использования клонированных ДНК для получения штаммов микроорганизмов, продуцирующих большие количества чужеродных белков, а следующий раздел будет посвящен изучению ряда ферментов, без которых невозможна технология рекомбинантных ДНК.