Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989

Кинетика процессов утилизации субстрата, образования продуктов метаболизма и биомассы в культурах клеток
Заключение

Как мы упоминали во введении к настоящей главе, конечной целью изучения кинетики клеточного роста является математическое количественное описание совместного влияния генетической природы организмов и среды на скорости процессов, осуществляющихся в популяции этих организмов. В настоящее время мы располагаем целым рядом частных моделей, одни из которых учитывают незначительные генетические изменения, другие — небольшие отклонения в составе среды, а третьи описывают гетерогенность клеток культуры. Учитывая ограниченную применимость каждой из таких моделей, специалист в области биохимической технологии должен прежде всего четко определить предполагаемую сферу использования данной кинетической модели и в соответствии с этим придать ей необходимую форму и глубину.

Громадные успехи фундаментальных биологических наук и вычислительной техники в будущем позволят создать более надежные, более глубокие и более механистические модели кинетики клеточного роста.

В этой главе мы изучили зависимости между ростом биомассы, утилизацией субстрата и образованием продуктов жизнедеятельности клеток. Экспериментальные данные помогли нам выяснить основные характеристики роста популяций клеток и филаментозных организмов. Мы рассмотрели также математические модели роста популяций микроорганизмов, необходимые для анализа и проектирования технологических процессов с их участием.

Гл. 9 посвящена вопросам расчета, проектирования и анализа различных биологических реакторов периодического и непрерывного действия; при обсуждении этой темы мы будем опираться в основном на рассмотренные в настоящей главе математические выражения, описывающие скорость процессов.

Прежде чем перейти к анализу биологических реакторов, нужно изучить кинетику еще одного класса явлений, а именно процессов транспорта в макроскопических системах. Здесь мы имеем в виду транспорт кислорода, хлора и других газов в жидкостях, использующийся, например, при аэрации и хлорировании. Такие транспортные явления в основе своей тесно связаны с характерными для биореакторов процессами естественной или вынужденной конвекции. Последние в свою очередь невозможно рассматривать без учета потребляемой биореактором мощности. Транспортные явления необходимо учитывать к при масштабировании биореакторов. В стерилизации и других процессах биохимической технологии большую роль играет также теплообмен. Все эти проблемы и ряд других вопросов мы рассмотрим в следующей главе.

Упражнения

7.1. Кинетика периодического процесса брожения. Натуральный виноградный сок содержит почти все питательные вещества, необходимые для роста дрожжей. Выполните следующую лабораторную работу по брожению.

а) Приобретите или соберите сами простейшую установку для получения пива или вина. Для получения вина вам потребуются виноградный сок (в этом эксперименте необходим сок, не содержащий нерастворимых твердых частиц), сахар, дрожжи, сосуд емкостью 3,8 л, небольшой химический стакан и отводная трубка, соединенная с водяным затвором.

б) Проведение процесса брожения. Суспендируйте активные дрожжи в 100 мл теплой кипяченой воды; смесь тщательно перемешайте, чтобы в суспензии не оставалось комков дрожжевой массы. В ферментер (стерилизованный кипящей водой или раствором сульфита натрия) поместите 0,95 л виноградного сока, 1,35 кг сахара и добавьте дистиллированной воды (с температурой чуть выше комнатной) до трех четвертей объема ферментера. Проследите за тем, чтобы над жидкостью осталось достаточно места для небольшого ареометра, и предусмотрите, чтобы ареометр можно было вводить через крышку ферментера. Добавьте дрожжевую суспензию, плотно закройте сосуд и энергично встряхивайте в течение 30 с. В реакционную смесь опустите ареометр. Закройте ферментер пробкой с одним отверстием, в которое вставлена соединенная с водяным затвором отводная трубка: уровень воды в затворе должен быть примерно на 1 см выше уровня отводной трубки.

в) Регистрируйте ход ферментации во времени (в течение недели), контролируя: 1) скорость выделения СО₂ при постоянной разности высот отводной трубки и водяного затвора (придумайте способ определения объема одного пузырька СO₂); 2) показания ареометра (проследите за тем, чтобы не нарушалась герметичность системы).

г) Выразите результаты в графической форме; обсудите графики в связи с кажущимися периодами клеточного роста и зависимостью между скоростями образования этанола и СО₂ (четко сформулируйте все допущения). Зная количество введенного в реакционную смесь сахара (содержащегося в виноградном соке и кристаллической сахарозе), массу сухого клеточного вещества в конце процесса и результаты предыдущего упражнения (пункт в), составьте уравнение материального баланса по углероду; сформулируйте принятые в уравнении допущения.

д) Считается, что очень чувствительными измерительными устройствами являются органы чувств человека. Попробуйте продукт вашего эксперимента на запах и вкус!

7.2. Зависимость скорости клеточного роста от температуры. Джонсон, Эйринг и Полиссар (The Kinetic Basis of Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY., 1954) предложили следующее уравнение для зависимости удельной скорости роста μ Е. coli от температуры в диапазоне от 18 до 43 °С:

где a = 0,3612е^24,04; ∆H₁ = 15 ккал/моль; ∆H₂ = 150 ккал/моль; ∆S = 476,46 кал/ /(г-моль∙К).

а) Начертите график этой функции в виде зависимости ln μ от 1/Т.

б) Покажите, что это уравнение можно представить в виде произведения двух функций, форма которого предполагается графиком упражнения 7.2а. Как можно объяснить физический смысл этих двух функций и значений приведенных выше параметров?

в) Какие связанные с необратимой инактивацией допущения приняты в этой интерпретации зависимости μ, от Г?

7.3. Кинетика микробиологических процессов с одним и несколькими субстратами. Культура растет на простой среде, содержащей 0,3% (масса/объем) глюкозы. В момент времени t = 0 культуру (как инокулят) разбавляют большим объемом идентичной стерильной среды. Процесс роста культуры контролируют по изменению оптической плотности (OD) при 420 нм во времени; полученные данные приведены в столбце 1 табл. 7У3.1. В столбце 2 той же таблицы указано изменение OD этой же культуры, выросшей в сложной среде и разбавленной питательным раствором, содержащим 0,15% глюкозы и 0,15% лактозы (масса/объем). Допустим, что OD (при 420 нм) пропорциональна концентрации клеточной массы, причем OD, равная 0,175, соответствует концентрации 0,1 мг клеток (в расчете на массу сухого вещества) в 1 мл. Рассчитайте максимальную удельную скорость роста μmах, продолжительность лаг-фазы tlag и общие экономические коэффициенты Y (выраженные числом граммов клеток на 1 г субстрата) при условии, что субстрат всегда утилизируется полностью. Объясните форму кривых роста для каждого случая.

Таблица 7У3.1^а

^а Из работы: Biochemical Reasoning. Kerridge D., Tipton K. (eds.), prob. 39, W. B. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif., 1972.

^б Определению оптической плотности предшествовало разведение пробы равным объемом не содержащей клеток среды.

7.4. Кинетика инактивации и гибели клеток; хлорирование. Предложено несколько уравнений, описывающих скорость инактивации или гибели клеток; опубликованное одним из первых уравнение предусматривало экспоненциальное снижение во времени численности активных спор возбудителя сибирской язвы в присутствии 5%-ного фенола [Chick Я., Investigation of the Laws of Disinfection, J. Hyg., 8, 698 (1908)]. Соответствующее уравнение инактивации dN/dt = -kN часто называют законом Чика. Применялись и три другие математические модели:

В трех последних уравнениях кажущаяся константа скорости процесса первого порядка изменяется во времени.

а) Проинтегрируйте каждое из приведенных уравнений; покажите, какую форму будут иметь кривые соответствующих графических зависимостей и как с помощью этих графиков можно определить параметры каждой из моделей.

б) В табл. 7У4.1 приведены данные, отражающие зависимость степени инактивации популяции Е. coli от времени и концентрации хлора. Соответствуют ли эти данные какому-либо из приведенных выше уравнений?

Таблица 7У4.1. Зависимость скорости инактивации клеток Е. coli от концентрации хлора и времени экспозиции (pH 8,5; 2—5°С); указана доля (в %) клеток, сохранивших жизнеспособность^а

^а Из работы: Fair G. М« Geyer J. С., Okan D. A., Water and Wastewater Engineering, pp. 31—39, John Wiley and Sons. Inc., New York, 1968.

в) Для данного дезинфицирующего агента время, в течение которого гибнет или инактивируется определенная часть популяции, выражается уравнением (концентрация)а (время) = const. При инактивации хлором (в виде НОСl) величина а равна 0,86 для Е. coli, 3 для аденовирусов, 1 для вируса полиомиелита и 2 для вируса А Коксаки. Объясните, почему можно было (или нельзя) ожидать подобную изменчивость значений а.

7.5. Кинетика клеточного роста и образования продуктов жизнедеятельности клеток. Конак предложил обобщенное логистическое уравнение [Аn Equation for Batch Bacterial Growth, Biotech. Bioeng., 17, 271 (1975)):

где N∞ — масса популяции в стационарной фазе; а, b — константы; N — клеточная масса.

а) Покажите, что максимальная скорость роста достигается при N/N∞ = а/ (а+b) и что ее величину можно определить по уравнению

б) Покажите, как вы могли бы определить каждый из параметров модели, используя указанные уравнения и наброски соответствующих графиков.

в) Покажите, что путем подстановки Р вместо N только в левую часть уравнения и подбора соответствующих а и b можно получить выражение, описывающее скорость образования продукта жизнедеятельности клеток в соответствии с сопряженным с ростом, несопряженным с ростом или смешанным механизмами, отвечающими рассмотренной в этой главе модели Льюдикина и Пайрета.

7.6. Пути клеточного метаболизма и кинетика образования продуктов жизнедеятельности клеток, а) Объясните, почему часто труднее описать количественно кинетику образования продуктов жизнедеятельности, чем кинетику утилизации субстрата или образования биомассы.

б) Изучите литературу, описывающую биохимию, методы и технологию микробиологического производства какого-либо антибиотика, витамина или аминокислоты. Составьте краткий обзор, в котором опишите стадии микробиологического синтеза, укажите (если имеются соответствующие данные) медленные и равновесные стадии, а также наличие процессов ингибирования или активации, индукции или репрессии ферментов. В заключение на основании последовательности реакций биосинтеза предложите (или обсудите уже описанную в литературе) кинетику образования этого метаболита.

7.7. Модуль Тила клетки. Показано, что модули Тила многих клеток и клеточных органоидов (мембран, митохондрий, рибосом и т. п.) равны или чуть меньше единицы [Weisz Р. В., Science, 179, 433 (1973)]. Объясните причину этого явления с количественной точки зрения, допуская, что клетки могут продуцировать ферменты в очень широком диапазоне концентраций. Для простоты примите, что в системе присутствует только один фермент. В ваших рассуждениях учтите объемную скорость, общую скорость роста, энергетические и другие затраты в процессе синтеза фермента. Обратите внимание на то, что указанная величина модуля Тила предполагает, что определенная в отсутствие внешнего сопротивления массопередаче кинетика клеточных процессов (гл. 4) будет отражать истинную кинетику этих процессов, как и предполагалось во всех разделах гл. 7.

7.8. Кинетика двойного ингибирования. Показано, что рост Candida utilis на ацетате натрия ингибируется субстратом (ацетатом) и pH [Jackson J. V., Edwards V. Н., Biotech. Bioeng., 17, 943 (1975)].

а) Выразите скорость роста С. utilis через соответствующие константы, а также концентрации ионов водорода и всего субстрата при следующих допущеннях:

1. Зависимость степени ингибирования субстратом от общей концентрации субстрата аналогична неконкурентному ингибированию фермента субстратом и может быть описана уравнением Эндрюса [уравнение (7.32)].
2. Максимальная скорость ростаμ_mахявляется аналогичной функцией от концентрации ионов водорода.
3. Субстрат проявляет ингибиторную активность только в протонированной форме, т. е. существует равновесиеHS(активный ингибитор)⇄ S^-(неактивный ингибитор) + Н⁺.

б) Покажите, как кривая зависимости 1/μ, от 1/s (в координатах Лайнуивера — Бэрка) будет изменяться в зависимости от pH. Как можно определить параметры этой модели?

Аналогично pH влияет и на ряд процессов, использующихся при обработке сточных вод. Пример кинетики анаэробного микробиологического процесса приведен в разд. 14.4.6.

7.9. Кинетика Моно в ПРПП. Рассмотрим организм, кинетика роста которого подчиняется уравнению Моно при μmах = 0,5 ч^-1 и Ks = 2 г/л.

а) При какой скорости разведения D будет обеспечена максимальная общая скорость образования клеточной массы, если принять, что культура находится в стационарном состоянии, содержимое проточного реактора полностью перемешивается, в культуре клетки не гибнут и S₀ = 50 г/л, Y = 1 (г клеточной массы/г субстрата)?

б) Сколько последовательных реакторов одинаковой емкости потребуется для снижения концентрации субстрата до 1 г/л при найденном в предыдущем упражнении значении D?

7.10. Особенности расчета ПРПП при ингибировании клеточного роста.

а) Постройте график зависимости х и s от D

где S₀ = 10 г/л, x₀ = 0, K_s = 1 г/л, K_i = 0,01 г/л, i = 0,05 г/л, μ_mах = 0,5 ч^-1, Y_x/s = 0,1 г клеток/г субстрата. На том же чертеже постройте графики зависимостей x и s при i = 0.

б) Предположим, что ПРПП был предназначен для работы в отсутствие ингибиторов. Найдите уравнения, определяющие отношения [s/s_i) и xD/(xD)_i, т. е. отношения предсказываемых моделью концентрации субстрата и скорости роста биомассы к соответствующим наблюдаемым величинам. Как присутствие ингибитора влияет на поведение реактора в отношении (xD)_max и вымывания?

в) Повторите решение упражнений 7.10, а и 7.10,6 при условии, что і зависит от x (і = x/10).

7.11. Экономический коэффициент. Если при моделировании кинетики клеточного роста учитывается эндогенный метаболизм или энергия поддержания клеток, то соответствующее уравнение (если допустить, что субстрат имеется в избытке) можно записать в следующей форме:

где Y' — экономический коэффициент клеточного роста (количество граммов клеток, образующихся из 1 г субстрата, расходуемого на рост клеток); k_e — количество граммов субстрата, расходуемого на энергию поддержания 1 г клеток; Y — кажущийся экономический коэффициент (количество граммов субстрата, расходуемого на образование 1 г клеточной массы). Зависимость экономического коэффициента от скорости разведения (в двойных обратных координатах) изображена на рис. 7У11.1.

РИС. 7У11.1. Зависимость экономического коэффициента от скорости разведения в двойных обратных координатах. [Воспроизведено из работы: Kirsh. Sykes, Prog. Ind., Microbiol., 9, 155 (1971); данные заимствованы из работы: Tempest D. W., Herbert D., Phipps P. J., in Microbial Physiology and Continuous Culture, Powell E. O. et al. (eds.), HMSO, London, 1967.]

РИС. 7У12.1. Схема и стехиометрия биосинтеза лимонной кислоты (АсСоА — ацетил-СоА; СІТ — цитрат; G6P — глюкозо-6-фосфат; GLU — глутамат; ІСТ — изоцитрат; MAL — малат; ОАА — оксалоацетат; OGT — а-кетоглутарат; PYR — пируват; SUC — сукцинат; GOX — глиоксилат). [Воспроизведено с разрешения из работы: Aiba S., Matsuoka М., Identification of Metabolic Model: Citrate Production from Glucose by Candida lipolytica, Biotech. Bioeng., 21, 1373 (1979).]

а) Покажите, что для ПРПП х и s связаны соотношением

б) Каким уравнением в этом случае должны быть связаны k_e, Y' и D?

в) Удовлетворяют ли этой модели данные по росту A. aerogenes на глицериновой среде, изображенные на рис. 7У11.1? Обоснуйте ваш ответ количественно.

7.12. Стехиометрия и скорости метаболических превращений. На рис. 7У12.1 приведена упрощенная схема биосинтеза лимонной кислоты в Candida lipolytica. На схеме символами обозначены важнейшие стехиометрические и кинетические параметры основных реакций в цикле ТКК и в глиоксилатном цикле. Здесь v_i — удельные скорости потоков углерода по различным метаболическим путям; ψсаг, ψ_рго и а_і— стехиометрические коэффициенты; μ — удельная скорость роста; v — удельная скорость утилизации глюкозы; Q_i— скорость образования определенных продуктов метаболизма. [Aiba S., Maisuoka М., Biotech. Bioeng., 21, 1373 (1979).]

а) Допустив, что все метаболиты находятся в квазистационарном состоянии, найдите выражения, связывающие собственные скорости элементарных реакций с наблюдаемыми общими скоростями процессов утилизации глюкозы, образования СO₂, цитрата и изоцитрата.

б) Запишите уравнение общего материального баланса по углероду. Зависит ли это уравнение от выражений, найденных вами при решении упражнения 7.12, а?

в) Для оценки важности отдельных путей метаболизма в биосинтезе цитрата были предложены две модели, в одной из которых отсутствует глиоксилатный цикл (v₇ = 0), а во второй блокирован цикл ТКК (v₈ = 0). С помощью найденных вами в двух предыдущих упражнениях уравнений и экспериментальных данных, приведенных в таблице 1 статьи Аибы и Мацуоки, вычислите относительные внутриклеточные метаболические потоки для указанных двух моделей при D = 0,122 и 0,0769 ч^-1. Какая из двух моделей, судя по результатам ваших расчетов, представляется более обоснованной?

7.13. Зависимость максимальной продуктивности и вымывания от скорости разведения, а) С помощью уравнений (7.16) и (7.18) покажите, что отношение D_m0/D_w0(m₀ — максимальная продуктивность; w₀ — вымывание) зависит только от (s_f/K_s) и определяется выражением

б) Покажите, что в предельных случаях предыдущее уравнение можно преобразовать следующим образом:

в) Выскажите ваши соображения относительно стабильности работы реактора и возможности его регулирования в предельных случаях, описанных в пункте б.

г) Найдите выражения для Y_P/Х = f(D) и соответствующей производной df/dD, справедливые при максимальной продуктивности (pD)_mах.

7.14. Кинетика ингибирования. Если рост микроорганизма ингибируется летучим продуктом его жизнедеятельности (например, этанолом), то скорость роста клеток можно повысить за счет постоянного вакуумирования пространства над культуральной жидкостью.

а) Покажите, что для периодического процесса, описываемого уравнением (7.33), временная зависимость концентрации субстрата для суммарной реакции S→0,3 P+клеточная масса выражается уравнением

где х — концентрация биомассы (г/л). Экономический коэффициент Y_x/s считайте постоянным.

б) Путем интегрирования приведенного выше уравнения найдите выражение, определяющее отношение x(t)/x_i(t), где x и x_i — концентрации биомассы в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно.

в) Определите отношение x(t)/x_i(t) (см. пункт б) при x₀ = 10^-6 г/мл, Y_X/S = 0,1 г клеток/г субстрата, К_s = 0,22 г/л, μ_mах = 0,408 ч^-1, K_I = 16 г/л для двух концентраций субстрата: s₀ = 5,0 г/л и s₀ = 70 г/л (примите, что молекулярная масса S втрое больше молекулярной массы Р).

7.15. Лаг-фаза в периодическом процессе, а) Показано, что при росте Aerobacter aerogenes в периодическом процессе в аммониево-сульфатной среде продолжительность лаг-фазы (t_lаg) приблизительно пропорциональна объему инокулята и обратно пропорциональна концентрации клеток в инокуляте [3]. Предложенная Дином и Хиншелвудом [3] модель объясняет этот факт тем, что лаг-фаза завершается тогда, когда концентрация определенного вещества А в клетке достигает порогового значения с'. Эти исследователи предположили также, что в лаг-фазе концентрация с вещества А изменяется во времени следующим образом:

с = аV + а'n₀t + а''t       (1)

где V — объем инокулята; а — концентрация вещества А в единице объема инокулята; n₀ — число клеток в единице объема культуры (значение n₀ можно считать постоянным, поскольку скорость роста клеток в лаг-фазе ничтожно мала); а' — среднее повышение концентрации вещества А (обусловленное его синтезом другими клетками) в единицу времени в расчете на одну клетку; а" — повышение концентрации вещества А за счет внутриклеточного синтеза. С помощью уравнения (1) определите t_lag и обсудите полученный вами результат в связи с экспериментально наблюдаемой зависимостью. Проанализируйте допущения, принятые при выводе уравнения (1).

б) Известно, что на длительность лаг-фазы влияет состояние популяции инокулята. Предположим, что инокулят содержит п₀ жизнеспособных клеток и n_d мертвых клеток и что рост жизнеспособных клеток начинается сразу же после инокуляции и происходит с постоянной удельной скоростью μ. Определите зависимость μ_арр (наблюдаемой кажущейся удельной скорости роста, оцениваемой по общей концентрации клеток) от времени. Опираясь на полученные результаты, выскажите ваши соображения о влиянии жизнеспособности инокулята и числа клеток в нем на кажущуюся длительность лаг-фазы.

7.16. Рост популяции микроорганизмов. Найден новый микроорганизм, при делении которого из каждой родительской клетки образуются три дочерние. По приведенным ниже экспериментальным данным, отражающим рост популяции, вычислите среднее время между двумя последовательными делениями клеток.

7.17. Кинетика биотрансформаций. Связанный с твердой поверхностью монослой клеток катализирует превращение субстрата S в продукт Р, причем рост клеток незначителен. Предположим, что скорость утилизации субстрата единицей поверхности описывается уравнением

где

поскольку Р ингибирует реакцию. В указанных уравнениях s и р— концентрации S и Р соответственно на поверхности.

Концентрации S и Р в растворе вдали от поверхности равны s₀ и р₀ соответственно. Коэффициенты массопередачи S и Р равны h_s и h_p соответственно.

Выразите скорость образования Р на единице поверхности через наблюдаемые концентрации в растворе s₀ и р₀, если из каждого моля S образуется Y_P/S молей Р.

7.18. Математические модели образования продуктов жизнедеятельности клеток и метаболизма поддержания. Неоднократно высказывались предположения, что модель Льюдикина—Пайрета, связывающая клеточный рост с образованием продукта метаболизма [уравнение (7.93)]:

r_fp = aμх + βх

и разработанная Пертом [Proc. Royal Soc., Series В, 163, 224—231 (1965)] модель, отражающая затраты энергии на поддержание:

где Y — наблюдаемый экономический коэффициент в расчете на субстрат; Y' — теоретический (без учета расхода на метаболизм поддержания) экономический коэффициент; m — коэффициент метаболизма поддержания (г субстрата/г клеток в час), эквивалентны. Согласны ли вы с этим предположением? Обоснуйте ваш ответ.

7.19. Структурированная модель клеточного роста Уильямса. Рассуждая так, как рассуждал Уильямс, разделим биомассу на две части. В первую часть мы включим промежуточные соединения, ферменты и другие компоненты, участвующие в образовании структурного и генетического материала клетки; это будет эквивалентом синтетической части биомассы в модели Уильямса. Вторую часть составит структурный и генетический материал биомассы. Предположим, что доли первой и второй частей биомассы составляют f₁и f₂от общей биомассы; сумма f₁и f₂ равна единице.

Запишем уравнения модели в собственной форме:

где

а — количество синтетической части биомассы, образующейся при утилизации одной единицы массы лимитирующего скорость роста субстрата;

β — количество структурной (генетической) биомассы, образующейся при утилизации одной единицы массы синтетической биомассы.

а) Рассмотрим сбалансированный рост, при котором f₁ = f₂ = 0; такое состояние может быть достигнуто в том случае, если s будет постоянным достаточно длительное время. Каким образом р зависит от s в состоянии сбалансированного роста?

б) Покажите, что модель Моно будет приблизительно соответствовать состоянию сбалансированного роста, если K₂ ≫ 1 и k₂ ≫ ak₁K₂. Чему (приближенно) в этом случае будут равны f₁ и f₂?

в) Пусть x₁ = cf₁ и x₂ = сf₂, где c = x₁ + x₂. Напишите дифференциальные уравнения для х₁, х₂ и s, описывающие систему хемостата. Напишите также дифференциальное уравнение для плотности популяции л; примите, что y [количество структурного (генетического) материала в клетке) постоянно.

г) Постройте графики зависимостей lg с от t, lg n от t и m (средний размер клеток m = с/n) от t для клеточного роста в периодическом процессе при двух различных начальных значениях f₁ : f₂ = 0,40 и f₁ = 0,05. И в первом, и во втором случае примите, что c₀ = 2∙10^-3 г/л и s₀ = 5,0 г/л. При построении используйте следующие константы: a = ß = 0,50; k₁ = 6,0 ч^-1; k₂ = 3,0 ч^-1; K₁ = 0,2 г/л; К₂ = 0,25 г/л; масса клетки 1,1∙10^-13 г.

д) С помощью параметров, перечисленных в пункте 7.19, г, постройте график, отражающий изменение μ, в зависимости от s для состояния сбалансированного роста. На том же чертеже постройте график зависимости μ от s в соответствии с уравнением Моно. Константы μ_m и K_sв уравнении Моно подберите таким образом, чтобы р асимптотически приближалось к постоянной величине при больших значениях s и чтобы производная от μ по s при s = 0 имела бы одно и то же значение и в модели Моно, и в общей модели.

е) Постройте графики зависимости с, s и т от скорости разведения для стационарного хемостата при s_j = 5,0 г/л.

ж) Как будут изменяться c₁, s и m при «сдвиге» условий в хемостате от D = 0,1 ч^-1 до D = 0,3 ч^-1 и от D = 0,3 ч^-1 до D = 0,1 ч^-1? Примите, что «сдвигу» предшествует стационарное состояние сбалансированного роста.

з) Обсудите полученные вами расчетные данные в сравнении с действительным поведением популяций бактерий.

Литература

В перечисленных ниже журналах публикуются результаты работ, посвященных изучению кинетики роста популяций клеток, а также многим другим аспектам биохимической технологии и прикладной биологии: Biotechnology and Bioengineering, Enzyme and Microbial Technology, Biotechnology Letters, Journal of Fermentation Technology, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, Journal of Applied Chemistry and Biotechnology, Process Biochemistry, Trends in Biotechnology, Agricultural and Biological Chemistry, Applied Microbiology, Applied Biochemistry and Microbiology и другие. Многотомное издание Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology (ранее Advances in Biochemical Engineering) публикует великолепные обзорные статьи, в которых часто рассматриваются перспективы развития биохимической технологии. Обзорные и оригинальные статьи печатают также Annual Reports on Fermentation Processes, публикуемые в Annals of the New York Academy of Science издания, посвященные биохимической технологии, и ежегодники Progress in Industrial Microbiology, Society for General Microbiology Symposium.

1. Biochemical and Biological Engineering Science, Blakebrough N. (ed.), vol. 1, Academic Press, Inc., New York, 1967.Здесь содержится полезный материал справочного характера по конструкциям биологических реакторов. Особенно рекомендуется гл. 6(Luedeking R., Fermentation Process Kinetics).
2. Аиба Ш., Хемфри А., МиллисH., Биохимическая технология и аппаратура.— М.: Пищевая промышленность, 1978. В этом углубленном пособии по биохимической технологии рассматривается кинетика периодических процессов (гл. 4), подробно обсуждены непрерывные процессы (гл. 5), а глава 9 посвящена проблемам стерилизации жидкостей.
3. DeanА. С. R., Hinshelwood С. N., Growth, Function and Regulation in Bacterial Cells, Oxford University Press, London, 1966. Помимо методов математического анализа метаболических превращений в этой монографии рассмотрено множество экспериментальных данных по другим проблемам клеточного роста и его регуляции. Эта книга настоятельно рекомендуется в качестве дополнительной литературы; ее единственным недостатком является необоснованный скептицизм по отношению к молекулярной биологии.
4. Microbial Growth, DawsonР. S. S. (ed.), Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., Stroudsburg, Pa., 1974. Превосходный сборник множества уже ставших классическими работ (в том числе оригинальной работы Моно), посвященных изучению роста микроорганизмов.
5. Roels J. A., Energetics and Kinetics in Biotechnology, Elsevier, Amsterdam, 1983.В этой монографии хорошо описаны как кинетические модели роста микроорганизмов и образования продуктов их жизнедеятельности, так и связанные проблемы химической термодинамики.
6. Foundation of Biochemical Engineering: Kinetics andTermodynamice in Biological Systems, ACS Symposium Series 207, Blanch H. W., Papoutsakis E. T., Stephanopoulos G. (eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1983. Довольно полная подборка обзорных статей по кинетике различных процессов от ферментативных реакций до роста популяций клеток.

Очень полезно ознакомиться со следующими обзорными статьями по математическому моделированию клеточного роста:

7. TsuchiyaН. М., Fredrickson A. G., Aris R., Dynamics of Microbial Cell Populations; Adv. Chem. Eng., 6, 125 (1966).
8. Fredrickson A. G., Megee R. D., III, Tsuchiya H. M. Mathematical Models for Fermentation Processes, Adv. Appl.Microbiol., 23, 419 (1970).

В приведенных ниже работах рассматриваются проблемы угнетения роста микроорганизмов продуктами метаболизма и субстратами:

9. Aiba S., SkodaМ., Nagatani М., Kinetics of Product Inhibition in Alcohol Fermentation, Biotech. Bioeng., 10, 845 (1968).
10. Aiba S., Skoda M., Reassessment of the Product Inhibition in Alcohol Fermentation, J. Ferment. Technol. Japan, 47, 790 (1969).
11. Andrews J. F., A Mathematical Model for the Continuous Culture of Microorganisms Utilizing Inhibitory Substrates, Biotech. Bioeng., 10, 707 (1968).

Следующие статьи посвящены росту филаментозных организмов и образованию продуктов их жизнедеятельности.

12. MetzВ., Kossen N. W. F., The Growth of Molds in the Form of Pellets — A Literature Review, Biotech. Bioeng., 19, 781 (1977).
13. Megee R. D., Kinoshita S., Fredrickson A. G., Tsuchiya H. M., Differentiation and Product Formation in Molds, Biotech. Bioeng., 12, 771 (1970).
14. Matsumura M., Imanaka T., Yoshida T., Taguchi H., Modeling of Cephalosporin C Production and Its Application to Fed-batch Culture, J. Ferment. Technol.Japan, 59, 115 (1981).

Со структурированными моделями клеточного роста можно ознакомиться в работах [5—8], а также в следующих статьях:

15. Fredrickson A. G., Formulation of Structured Growth Models, Biotech. Bioeng.. 18,1481 (1976).
16. Williams F. M., A Model of Cell Growth Dynamics, J. Theoret. Biol., 15, 190 (1967).
17. Harder A., Roels J. A., Application of Simple Structured Models in Bioengineering, in Advances in Biochemical Engineering, vol. 21, Fiechter A. (ed.), p. 55,Springer-Verlag,Berlin, 1982.
18. Bijkerk A. H. E., Hall R. J., A Mechanistic Model of the Aerobic Growth ofSaccharomycescerevisiae, Biotech. Bioeng., 19, 267 (1977).
19. PammentN. В., Hall R. Barford J. Р., Mathematical Modeling of Lag Phases in Microbial Growth, Biotech. Bioeng., 30, 349 (1978).
20. Shuler M. L.,DomachM. AL, Mathematical Models of the Growth of Individual Cells, in Foundations of Biochemical Engineering, Blanch H. W., Papoutsakis E. T., Stephanopoulos G. (eds.), p. 101, American Chemical Society, Washington, D.C., 1983.
21. Ramkrishna D., A Cybernetic Perspective of Microbial Growth, in Foundations of Biochemical Engineering, Blanch H.W.,Papoutsakis E. T., Stephanopoulos G. (eds.), p. 161, American Chemical Society, Washington, D.C., 1983.
22. Kompala D. S., Ramkrishna D., Tsao G. T., Cybernetic Modeling of Microbial Growth on Multiple Substrates, Biotech. Bioeng., 26, 1272 (1984).

Кинетика образования продуктов метаболизма рассмотрена в следующих статьях:

23. GadenЕ. L., Chem. Ind. Rev., 154 (1955), J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng., 1 413 (1959).
24. Deindoerfer F. H., Adv. Appl. Microbiol., 2, 321 (1960).
25. OllisD. F., A Simple Batch Fermentation Model: Theme and Variations, Ann. N.Y. Acad. Sei. USA, 413, 144 (1983).
26. Pazoutova S., Votruba J., Rehdcek Z., A Mathematical Model of Growth and Alkaloid Production in the Submerged Culture of Claviseps purpurea, Biotech. Bioeng., 23, 2837 (1981).
27. Lee S. B., Bailey J. E., Analysis of Growth Rate Effect of Productivity of Recombinant EscherichiacoliPopulations, Biotech. Bioeng., 26, 66 (1984).
28. Lee S. B., Bailey J. E., Genetically Structured Models for lac Promoter — Operator Function in the EscherichiacoliChromosome and in Multicopy Plasmids: lac Operator Function, Biotech. Bioeng., 26, 1372 (1984).

В перечисленных ниже статьях описаны сегрегированные кинетические модели.

29. Ramkrishna D., Statistical Models of Cell Populations, Adv. in Biochem. Eng, 11, 1 (1979).
30. Nishimura Y., Bailey J. E., On the Dynamics of Cooper — Helmstetter — Donachie Procaryote Populations, Math. Biosci., 51, 505 (1980).
31. Hjortso M. A., Bailey J. E., Steady-State Growth of Budding Yeast Populations in Well-Mixed Continuous Flow Microbial Reactors, Math. Biosci., 60, 235 (1982).
32. Shu P., Mathematical Models for the Product Accumulation in Microbial Processes, J. Biochem. Microbiol.Technol.Eng., 3, 95 (1961).

Великолепное введение в проблему стерилизации дано в статье:

33. Blakebrough N., Preservation of Biological Materials Especially by Heat Treatment, in Biochemical and Biological Engineering Science, vol. 2, Blakebrough N. (ed.), Academic Press, Inc., New York, 1968.

Факторы, влияющие на устойчивость организмов к стерилизации, обобщены в гл. 20 и 21 монографии Фробишера (ссылка (2] в гл. 1), а проблема

обезвреживания фагов рассмотрена в статье:

34. Hango etal, Phage Contamination and Control, in Microbial Production of Amino Acids, Kodansha Ltd., Tokyo, and John Wiley and Sons, Inc., New York, 1973.