Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989
Кинетика катализируемых ферментами реакций
Определение констант скоростей элементарных стадий ферментативной реакции
В разд. 3.2.2 мы рассмотрели различные графические способы определения параметров vmax и Кm, входящих в уравнение Михаэлиса — Ментеи. Как показывает анализ Бриггса — Холдейна, эти параметры определяются константами скоростей элементарных стадий реакции k1, k-1 и k2. В то же время из уравнений (3.10) и (3.11) следует, что знания параметров Кm и vmax еще недостаточно для определения скорости отдельных стадий реакции. Для оценки последних, очевидно, необходимо найти какие-то иные, независимые взаимосвязи между константами скоростей элементарных стадий и экспериментальными данными.
Такие более фундаментальные кинетические параметры представляют интерес по меньшей мере по двум причинам. Во-первых, они дают углубленное представление о реальных процессах, происходящих в ходе катализируемых ферментами реакций. Мы можем узнать, например, насколько быстро субстрат взаимодействует с ферментом, и сравнить эти величины со скоростью обратного процесса диссоциации комплекса ES. Во-вторых, как мы уже видели, упрощения, лежащие в основе уравнения Михаэлиса — Ментен, с достаточной точностью оправдываются только при относительно невысоких концентрациях фермента. Если это условие не соблюдается, то изучение кинетики ферментативной реакции возможно только при учете данных материального баланса для s, р и (es), для чего в свою очередь необходимо знать константы отдельных стадий реакции k1, k-1и k2. По указанным причинам нам представляется целесообразным рассмотреть здесь экспериментальные методы определения этих параметров и полученные с помощью таких методов результаты.
В методе кинетики предстационарного состояния основное внимание уделяется короткому периоду (около 1 с или меньше) сразу после начала реакции, когда приближение квазистационарного состояния еще неприменимо. В течение этого периода концентрация субстрата изменяется незначительно, что позволяет приближенно решить уравнения материального баланса для (es) и р. Сравнение найденной таким образом зависимости р от t с экспериментальными данными, а также найденные значения vmaxи Km дают всю информацию, необходимую для расчета k1, k-1и k2. Экспериментальной основой этого метода является методика остановленного потока, разработанная и развитая Б. Чансом с сотрудниками. Согласно этой методике, растворы фермента и субстрата быстро смешивают в кювете спектрофотометра; спектрофотометрический метод позволяет контролировать изменения концентраций исходных веществ и продуктов реакции, осуществляющиеся в течение нескольких миллисекунд.
Разработанные и широко применявшиеся Эйгеном и сотрудниками релаксационные методы дают возможность изучать реакции, завершающиеся в течение нескольких наносекунд. Существует несколько вариантов этого метода, но все они основаны на принципе возмущения равновесного (или стационарного) состояния реакционной смеси путем искусственного скачкообразного изменения некоторых условий реакции, например температуры, давления или напряженности электрического поля. Последующий отклик реакционной системы на это изменение регистрируют непрерывно. Как схематически показано на рис. 3.13, отклик на скачкообразное изменение условий реакции представляет собой не что иное, как переход в новое, почти равновесное или стационарное состояние.