Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Белки
Молекулярная масса белков

Молекулярную массу белка измеряют различными физическими методами: гравиметрическим, вискозометрическим, осмометрическим, ультрафильтраци­онным, гельфильтрационным, электрофоретическим, оптическим. Полученную величину принято называть физическим значением молекулярной массы белка; она определяется с точностью в несколько сотен, а иногда и тысяч дальтон. У многих белков в настоящее время выяснена первичная структура, что дает возможность рассчитать молекулярную массу с точностью до сотых долей дальтона, т. е. получить химическое значение молекулярной массы белка. Обычно оперируют значениями физических молекулярных масс белков, варьиру­ющих для всего спектра природных белков в очень широких пределах (табл. 3).

Таблица 3 Молекулярная масса, степень асимметрии молекул и изоэлектрические точки некоторых белков

Определение молекулярной массы белка гравиметрическим методом ве­дут в аналитических ультрацентрифугах (рис. 15). Принцип количественно­го изучения размеров взвешенных частиц в центробежном поле А. В. Думанский выдвинул еще в 1913 г., и он же пытался определить размеры частиц по скорости оседания в обычных лабора­торных центрифугах. Однако первая ультрацентрифуга с оп­тической приставкой, позволяю­щей наблюдать и фотографиро­вать процесс седиментации (осе­дания) частиц, была построена шведским физико-химиком Т. Сведбергом десятью годами позже. При вращении ее ротора развивалось центробежное уско­рение, превышающее ускорение силы тяжести всего в 150 раз.

В современных типовых ультрацентрифугах это пре­вышение достигает 300000, а в специализированных — 900000—1200000. Данную величину называют относительным центробежным ускорением или фактором разделения: Ф_р = ω^2r/g, где ω — угловая скорость ротора, рад/с; r — расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см; g — ускорение силы тяжести, см/с². Таким образом, например, запись 100 000 g означает, что центробежное уско­рение в месте расположения ячейки в роторе ультрацентрифуги превышает ускорение силы тяжести в 100000 раз. Величина достигаемого в ультрацент­рифуге фактора разделения — одна из важнейших ее характеристик.

Рис. 15. Устройство ультрацентрифуги:

1 и 2 — верхняя и нижняя стальные плиты; 3 — стенка стального цилиндра; 4 — стальная игла с под­вешенным ротором (ІІ); S — привод ротора; 6 — термопара; 7 — монтажная плита; 8 — электромаг­нитный затвор; 9 — металлический патрубок, соеди­няющий вакуумную камеру с фотоаппаратом; 10, 13 — верхнее и нижнее кварцевые окна; 12 — сталь­ной хвостовик ротора в направляющей втулке; 14 — гнездо ротора для ячейки, в которой наблюдают оседание белковых частиц

Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную для световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развива­емой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через опре­деленные промежутки времени и определять таким образом скорость оседа­ния белковых частиц. Определение молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования ведут двумя способами: по скорости седиментации белковых молекул и по седиментационному равновесию.

В первом случае измеряют скорость перемещения в ячейке ультрацент­рифуги границы растворитель — белок, относя ее к величине развиваемого центробежного ускорения т. е. находят константу седиментации: s = v/ω^2r, где V — скорость перемещения границы растворитель — белок, см/с, ω^2r — центро­бежное ускорение, см/с². Размерность s выражают в секундах. Величина константы седиментации, равная 10^-13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S, или Св). Вводя значение экспериментально найденной константы седиментации в формулу, рассчитывают молекулярную массу белка:

где R — газовая постоянная; Т — температура (по шкале Кельвина); D — коэффи­циент диффузии; р — плотность растворителя; σ — плотность белковых частиц.

Во втором случае измеряют концентрацию белка с₁ и с₂ в двух точках ячейки на расстоянии х₁ и х₂ от центра ротора в тот момент, когда после определенного срока работы ультрацентрифуги в ячейке установится седиментационное равно­весие, т. е. равенство между числом оседающих и диффундирующих в обратном направлении молекул белка. Расчет молекулярной массы белка ведут по формуле, вводя в нее экспериментально найденные значения с_1, с₂, х₁ и х₂:

где to — угловая скорость, а остальные обозначения те же, что в предыдущей формуле.

Из остальных перечисленных выше физических методов определения моле­кулярной массы белков широко применяют еще два: гельфильтрационный и электрофоретический.

Первый состоит либо в определении объема элюента, необходимого для выноса белка из колонки с гелем сефадекса (V_e), и соотнесении его со свобод­ным объемом колонки (V₀), либо в установлении длины пробега белка в тон­ком слое сефадекса на пластинке. И тот и другой показатели связаны зависи­мостью со значением молекулярной массы белка. Пользуясь калибровочными графиками, построенными по V_e/V₀ или по длине пробега маркерных (т. е. с известной молекулярной массой) белков, находят молекулярную массу исследуемого белка.

Второй метод состоит в измерении пути, пройденного белком при электро­форезе в полиакриламидном геле; здесь тоже существует зависимость между молекулярной массой белка и длиной пробега. Еще более отчетливо она выявляется при сопоставлении торможения пробега белка при переходе от электрофореза его в геле с меньшим содержанием акриламида к электрофоре­зу в геле с большим содержанием акриламида. В этом случае также строят калибровочные графики по маркерным белкам и по ним находят молекулярную массу неизвестного белка.

Другие физические методы определения молекулярных масс белков: по светорассеянию, вязкости и осмотическому давлению белковых растворов, по данным рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии — ис­пользуют крайне редко.

Некоторое распространение имеет химический метод. Сущность его заклю­чается в количественном определении в составе белка элемента или аминокисло­ты, содержащихся в нем в наименьшем количестве. Затем проводят расчет минимальной молекулярной массы, исходя из того, что в молекуле белка не может быть менее одного атома элемента или одного аминокислотного остатка. Однако об истинной молекулярной массе белка этот метод не всегда дает правильное представление. Например, гемоглобин (белок крови человека и животных) содержит 0,34% железа. Так как в гемоглобине не может содер­жаться менее одного атома Fe, то минимальная молекулярная масса гемоглоби­на рассчитывается по пропорции: 0,34 части Fe соответствует 100 частям белка, 56 частей Fe (один атом) соответствуют х частям белка, отсюда х = (56 ∙ 100)/ 0,34 = 16 500. Истинная молекулярная масса гемоглобина равна 66000—68000, т. е. учетверенной минимальной молекулярной массе. Это естественно, так как молекула гемоглобина содержит 4 атома Fe. Таким образом, химический метод определения молекулярной массы белков в определенной мере условен.