Гликопротеины - Хьюз Р. 1985

Строение
Определение последовательности
Ферментативный анализ

Ферменты, метаболизирующие сложные углеводы, служат очень ценным инструментом при структурных исследованиях, поскольку такие ферменты часто обладают весьма узкой специфичностью, В настоящее время чаще всего применяются гликозидазы [8], многие из которых получены в очищенном виде (табл, 2.3), Список гликозидаз, приведенный в табл. 2.3, не является исчерпывающим и не включает очень важного класса эндогликозидаз, которые рассматриваются ниже (разд.24) в связи с определенной сложностью их субстратной специфичности.

Таблица 2.3. Экзогликозидазы, используемые для определения моносахаридной последовательности гликозидаз, которые рассматриваются ниже (разд. 2.4) в связи с определенной сложностью их субстратной специфичности.

Рис. 2.4. Механизм действия экзогликозидаз.

Все ферменты, перечисленные в таблице, относятся к экзогликозидазам: они расщепляют гликозидную связь лишь в том случае, если моносахарид является концевым остатком в цепи. Большинство экзогликозидаз обладает высокой специфичностью в отношении углеводного субстрата и аномерной конфигурации гликозидной связи. Фермент, катализирующий реакцию, приведенную на рис. 2.4, является а-маннозидазой. ß-Маннозид не будет гидролизоваться под действием этого фермента. Кроме того, в зависимости от природы различных агликонов (R) многие экзогликозидазы гидролизуют соответствующие гликозиды с различной скоростью (в табл. 2.3 показаны хорошо изученные реакции). Типичный случай использования экзогликозидаз для определения последовательности моносахаридов у невосстанавливающих концов полисахаридной цепи показан на рис. 2.5. В качестве примера здесь приведено последовательное расщепление углеводной цепи основного гликопротеина орозомукоида с помощью нейраминидазы. Если этот интактный гликопротеин обработать нейраминидазон из Streptococcus pneumoniae (ранее называвшийся Diplococcus pneumoniae) то остатки сиаловых кислот отщепляются количественно. Из этого следует, что все остатки сиалвой кислоты в данном гликопротеине являются концевыми. В то же время обработка этого же белка ß-галактозидазой из S. pneumoniae не приводит к появлению свободных остатков галактозы. Однако после удаления сиаловой кислоты ß-галактозидаза отщепляет более 80% остатков галактозы, содержащихся в гликопротеине. Следовательно, разрываемая связь должна быть ß1→4 (табл. 2.3). Остаток N-ацетилглюкозамина, ставший концевым после обработки ß-галактозидазой, может в свою очередь быть отщеплен ß-N-ацетилглюкозаминидазой на этапе б. Таким образом, в данном простом случае мы определили последовательность моносахаридов с помощью набора специфических ферментов.

Pиc. 2.5. Последовательное расщепление олигосахарида орозомукоида экзогликозидазой из Streptococcus pneumoniae. R — коровая область олигосахарида, связанного с белком.