Основы биохимии Том 3 - А. Ленинджер 1985

Молекулярные механизмы передачи генетической информации
Еще о генах: репарация, мутации, рекомбинация и клонирование
Краткое содержание главы

Как в прокариотических, так и в эукариотических клетках содержатся ферментные системы, способные исправлять ошибки репликации и различные формы повреждения ДНК, вызываемые гидролизом или действием внешних мутагенов - ультрафиолетового излучения, ионизирующей радиации, а также дезаминирующих и алкилирующих агентов. Неисправленные с помощью механизма реперации повреждения ДНК приводят к наследуемым мутациям, которые могут быть летальными, неполностью подавляющими функцию, “молчащими” или даже благоприятными в зависимости от места и природы повреждения. Один из типов мутаций обусловлен встраиванием в ДНК неправильного основания, что приводит к изменению одного кодона и в большинстве случаев к замене одной аминокислоты в белковом продукте. Другой важный тип мутаций - это так называемые мутации со сдвигом рамки, которые представляют собой потерю или приобретение одного или нескольких нуклеотидов. Такие мутации вызывают сдвиг рамки считывания кодонов, в результате чего образуется белковый продукт, аминокислотная последовательность которого искажена, начиная с того места, где произошло выпадение или добавление нуклеотида. Мутации обычно возникают беспорядочно, однако вероятность их появления сильно возрастает под действием мутагенов, к которым относятся дезаминирующие и алкилирующие агенты, а также другие вещества, способные изменять структуру оснований. Почти все канцерогенные соединения являются мутагенами, что может быть проверено с помощью простых тестов, основанных на выращивании бактерий.

В нормальных природных условиях гены и наборы генов претерпевают рекомбинацию в ходе таких биологических процессов, как трансформация бактерий, вирусная трансдукция, конъюгация бактерий и обмен генов при слиянии половых эукариотических клеток. Гены и группы генов могут также перемещаться с одного места на другое как в пределах одной и той же хромосомы, так и между разными хромосомами. Например, белки-антитела, которые вырабатываются клетками крови (иммуноцитами) позвоночных против миллионов самых разных, не содержащихся в организме макромолекул (антигенов), кодируются последовательностями ДНК, возникающими в результате перемещения и перегруппировки сравнительно небольшого числа разных типов генов. При транскрипции с таких последовательностей могут синтезироваться самые разные мРНК для миллионов разных антител, каждый из которых способен специфически взаимодействовать с одним и только одним типом молекул антигена.

Новые комбинации генов можно создать и искусственным путем в лабораторных условиях с помощью таких ферментов, как рестриктирующие эндонуклеазы, ДНК-лигаза и терминальная трансфераза. Чтобы встроить чужеродный ген в геном клеток Е. coli, этот ген сначала пришивают к вектору, которым служит либо плазмида Е. coli, либо ДНК фага λ. Полученная рекомбинантная ДНК может затем попасть в клетку Е. coli, ковалентно включиться в ее хромосому и в составе этой хромосомы реплицироваться. Если новый ген, содержащийся в рекомбинантной ДНК, обладает подходящими сигнальными последовательностями, указывающими начало и конец транскрипции, то такой ген будет транскрибироваться и транслироваться с образованием соответствующего белкового продукта. Многие гены из животных клеток уже были введены в бактерии, а бактериальные гены в свою очередь были встроены в эукариотические клетки. С помощью бактерий, в геномы которых введены соответствующие гены, можно получать применяемые в медицине белковые препараты - инсулин, гормон роста и интерфероны.

ЛИТЕРАТУРА

Репарация, мутации и канцерогены

Ames В. N. Identifying Environmental Chemicals Causing Mutations and Cancer, Science, 204, 587-593 (1979).

Cairns J. The Cancer Problem, Sci. Am., 233, 64-78, November 1975. Вдумчивый анализ проблемы, сделанный молекулярным биологом.

Devoret R. Bacterial Tests for Potential Carcinogens, Sci. Am., 241,40-49, August 1979.

Drake J. М. The Molecular Basis of Mutation, Holden-Day, San Francisco, 1970.

Hanawalt P. et al. DNA Repair in Bacteria and Mammalian Cells, Annu. Rev. Biochem., 48, 783-836 (1979). Подробный обзор современного состояния проблемы.

Рекомбинация в природе

Ayala F. J., Kiger J. A., Jr. Modern Genetics, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1980. Дано описание бактериальной трансформации, вирусной трансдукции и бактериальной конъюгации.

Campbell А. М. How Viruses Insert Their DNA into the DNA of the Host Cell, Sci. Am., 235, 102-113, December 1976.

Cohen S.N., Shapiro J. A. Transposable Genetic Elements, Sci. Am., 242, 40-49, February 1980.

Антитела

Hood L.E., Weissman I.L., Wood W.B. Immunology, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1978.

Milstein C. Monoclonal Antibodies, Sci. Am., 243, 66-74, October 1980. Описана техника получения антител одного вида в больших количествах в культуре животных клеток.

Клонирование ДНК

и генетическая инженерия

Abelson J., Butz Е. (eds). Recombinant DNA, Science, vol. 209 (1980). Этот том целиком состоит из важных научно-исследовательских статей и содержит ценный словарь терминов.

Anderson W. В., Diacumakos Е. G. Genetic Engineering in Mammalian Cells, Sci. Am., 245, 106-121, July 1981.

Derobertis E. M., Gurdon J. B. Gene Transplantation and the Analysis of Development, Sci. Am., 241, 74-82, December 1979.

Grobstem, Clifford. The Recombinant-DNA Debate, Sci. Am., 237, 22-33, July 1977.

Industrial Microbiology and the Advent of Genetic Engineering, Freeman, San Francisco, 1981. Сборник статей, появившихся в сентябрьском номере журнала Scientific American, который посвящен генетической инженерии и использованию микроорганизмов в промышленности; особое внимание уделено генетическим изменениям и клонированию.

Setlow J. К., Hollaender A. (eds.). Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum, New York, 1979. Сборник статей, написанных специалистами.

Watson J.D., Tooze J. The DNA Story: A Documentary History of Gene Cloning, Freeman, San Francisco, 1981.

Интерфероны

Derynck R., Content J., Declercq E., Volckaert G., Tavernier J., Devos R., Fiers W. Isolation and Structure of a Human Fibroblast Interferon Gene, Nature, 285, 542-547 (1980).

Вопросы и задачи

1. Механизмы репарации ДНК

а) Как вы полагаете, почему УФ-эндонуклеаза расщепляет ДНК с 5'-стороны, а не с 3'-стороны от тиминового димера?

б) Почему маловероятно обнаружение таких ферментов, которые исправляли бы поврежденную мРНК столь же эффективно, как репарируется поврежденная ДНК?

в) На основании того, что вы знаете о механизмах репарации ДНК, предположите, каковы будут последствия повреждений гена рентгеновскими лучами, которые часто приводят к разрывам в обеих цепях ДНК?

2. Последствия замены одного основания. Перечислите возможные последствия мутации, вызванной заменой одного основания эукариотической ДНК в участке, кодирующем фермент.

3. Рекомбинация фрагментов, полученных с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Предположим, у вас есть две двухцепочечные молекулы ДНК - А и Б. Цепь 1 ДНК_А имеет последовательность

(5) ATATGAATTCAATT (3)

а цепь 1 ДНК_Б имеет последовательность

(5') CGCGGAATTCCCGG (3')

Обе ДНК расщепляют рестриктирующей эндонуклеазой Eco RI, полученные фрагменты смешивают, чтобы они смогли в смеси перекомбинироваться, и затем ковалентно сшивают с помощью ДНК-лигазы. Напишите последовательности всех ДНК, образующихся после рекомбинации. Укажите, какие из них окажутся новыми рекомбинантами.

4. Кодон UАА в качестве сигнала. Нуклеотидные остатки в прокариотической мРНК нумеруются таким образом, что остатки кодона AUG для инициирующего метионина белкового продукта (состоящего из 140 аминокислот) имеют номера 1, 2 и 3. Какое влияние на белковый продукт оказывает наличие в положениях 330-332, 334-336 и 338-340 триплета (5')UAA? Каким был бы ваш ответ в случае эукариотической мРНК?

5. Построение рестрикционной карты вируса. ДНК, выделенная из вируса, инфицирующего животные клетки, имеет обычное эквивалентное соотношение оснований и устойчива ко всем известным экзонуклеазам.

а) Что говорят вам эти факты о третичной структуре этой ДНК?

б) При расщеплении рестриктирующей эндонуклеазой Eco RI образуется один тип двухцепочечной ДНК с мол. массой 3,4∙10⁶. Что говорит о структуре ДНК такой результат?

в) При расщеплении исходной вирусной ДНК с помощью рестриктирующей эндонуклеазы Нра I из Haemophilus parainfluenzae образуются три фрагмента с мол. массами 1,4∙10⁶, 0,7∙106 и 1,3∙10⁶, которые можно разделить гель-электрофорезом. При совместном действии Есо RI и Нра I из исходной вирусной ДНК образуются четыре фрагмента. Самый большой из них имеет мол. массу 1,3∙10⁶, а самый маленький -0,6∙10⁶. Фрагменты обозначают буквами в соответствии с их размером (А-самый большой). Какова молекулярная масса двух других фрагментов, образовавшихся при совместном действии Eco RI и Нра I?

г) После частичного (т. е. неполного) расщепления вирусной ДНК обоими ферментами из электрофоретической полосы, соответствующей фрагменту с мол. массой 1,3∙10⁶, выделили ДНК и подвергли ее полному расщеплению с помощью Нра I. В результате получили три полосы, одна из которых обладала электрофоретической подвижностью, соответствующей мол. массе 1,3∙10⁶, а две другие полосы соответствовали двум меньшим фрагментам. Составьте возможную рестрикционную карту фрагментов А, Б, В и Г вирусной ДНК и укажите точки расщепления.

д) При полном расщеплении ДНК мутантного штамма этого же животного вируса рестриктирующими эндонуклеазами Eco RI и Нра I образуются только три фрагмента с мол. массами 2,1∙106, 0,6∙10⁶ и 0,7∙10⁶. Каково простейшее объяснение мутации, приведшей к изменению картины расщепления?

6. Функциональные домены в белках. Есть основания считать, что белки эукариот состоят из функциональных доменов, т. е. из независимых областей, каждая из которых определяет какое-либо свойство белка или его функцию. Было высказано предположение, что существование таких доменов выгодно с эволюционной точки зрения, поскольку участки ДНК, кодирующие каждый домен, могут обмениваться и рекомбинировать с образованием новых генов, кодирующих белки с новой комбинацией свойств и функций. Какие особенности эукариотической транскрипции могли бы привести к возникновению таких новых генов и почему?

7. Клонирование интерферона человека. Используя рекомбинантные ДНК, можно значительно увеличить наработку белков, присутствующих в клетке в малом количестве. Интерфероны - антивирусные, а возможно, и противораковые агенты — можно выделить из лейкоцитов человека, однако выход интерферона составляет всего 1 мкг из 1 л крови, поэтому при таком выделении он стоит очень дорого. Гены интерферонов можно клонировать и получить их экспрессию в бактериях, которые легко выращивать в количестве сотен и тысяч литров.

а) Подсчитайте, сколько интерферона можно получить в результате клонирования гена интерферона в бактериях, предполагая, что в 1 мл культуры, достигшей стационарной фазы, содержится 10⁹ бактериальных клеток, а в каждой клетке присутствует 10^-1 пг белка, 5% которого составляет интерферон.

б) Если мол. масса интерферона составляет 30000, то сколько молекул интерферона вырабатывает одна клетка? (Подсказка: число Авогадро, т. е. число молекул в одном моле вещества, равно 6,02∙10²³.)

в) Какое количество клонированного интерферона человека можно теоретически получить из 100 л культуры, если учесть данные, приведенные в п. б)?

8. Рекомбинация кольцевых ДНК. Предположим, у вас есть две кольцевые двухцепочечные ДНК - одна большая, другая маленькая, которые надо объединить в один кольцевой дуплекс. У вас есть рестриктирующая эндонуклеаза, которая может расщепить каждую ДНК лишь в одной точке с образованием в месте разрыва выступающих концов.

а) Каким образом вы осуществите соединение большой и малой ДНК в одно кольцо большего размера?

б) Укажите структуру основных побочных продуктов рекомбинации.