ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 3. ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ИНФОРМАЦИИ - 2017

ЧАСТЬ III. ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ИНФОРМАЦИИ

24. ГЕНЫ И ХРОМОСОМЫ

Вопросы и задачи

1. Упаковка ДНК в вирусах.

Молекулярная масса ДНК бактериофага Т2 составляет 120 • 10⁶; эта молекула ДНК упакована в головку бактериофага длиной 210 нм. Подсчитайте длину ДНК (определите молекулярную массу, зная, что в геноме 650 пар нуклеотидов) и сравните ее с размером головки Т2.

2. ДНК фага М13.

Нуклеотидный состав ДНК фага М13:23% А, 36% Т, 21% G, 20% С. Что на основании этих данных можно сказать о ДНК фага М13?

3. Геном Mycoplasma.

Полный геном самой маленькой бактерии Mycoplasma genitalium состоит из 580 070 п. н. и организован в виде кольцевой молекулы ДНК. Определите молекулярную массу и длину (в релаксированном состоянии) этой молекулы. Чему равно Lr₀ хромосомы Mycoplasma? Если σ = -0,06, чему равно Lk?

4. Размер генов эукариот.

Фермент, выделенный из печени крысы, содержит 120 аминокислотных остатков и кодируется геном, размер которого 1440 п. н. Объясните связь между числом ами

нокислотных остатков в ферменте и числом пар нуклеотидов в его гене.

5. Порядок зацепления.

Молекула замкнутой кольцевой ДНК в релаксированной форме имеет Lk = 500. Оцените приблизительно число пар нуклеотидов в этой ДНК. Как изменяется порядок зацепления (увеличивается, уменьшается, не изменяется, нельзя определить), если: (а) белковый комплекс присоединен к нуклеосоме; (б) одна нить ДНК разорвана; (в) к раствору ДНК добавлены ДНК-гираза и АТР; (г) двойная спираль денатурирована нагревом?

6. Топология ДНК.

В присутствии эукариотического конденсина и топоизомеразы типа II Lr релаксированной замкнутой кольцевой ДНК не изменяется. Однако в ней появляется множество узлов.

Образование узлов требует разрыва ДНК, прохождения участка ДНК через разрыв и лигирования под действием топоизомеразы. Учитывая, что топоизомеразная реакция должна сопровождаться изменением порядка зацепления, объясните сохранение величины Lk.

7. Плотность суперскрученной ДНК.

Бактериофаг λ инфицирует Е. coli, интегрируя свою ДНК в бактериальную хромосому. Успех такой рекомбинации зависит от топологии ДНК Е. coli. Если плотность сверхвитков ДНК Е. coli σ> -0,045, вероятность интеграции менее 20%; если σ < -0,06 — вероятность превышает 70%. Установлено, что длина плазмидной ДНК, выделенной из культуры Е. coli, составляет 13 800 п. н., a Lr = 1222. Рассчитайте, а для этой ДНК и предскажите вероятность того, что бактериофаг λ сможет инфицировать эти клетки.

8. Изменение порядка зацепления.

(а) Чему равно Lr кольцевой двухцепочечной молекулы ДНК размером 5000 п. н. с разрывом (ником) в одной цепи? (б) Чему равно Lr молекулы из задания (а) после лигирования разрыва (релаксации)? (в) Как могло бы измениться Lk молекулы из задания (б) в результате действия одной молекулы топоизомеразы I Е. coli? (г) Чему равно Lr молекулы из задания (б) после восьми актов действия одной молекулы фермента ДНК-гиразы в присутствии АТР? (д) Чему равно Lk молекулы из задания (г) после четырех актов действия одной молекулы бактериальной топоизомеразы I? (е) Чему равно Lr молекулы из задания (г) после связывания одной нуклеосомы?

9. Хроматин.

Экспериментальные доказательства, которые помогли определить структуру нуклеосом, были получены методом электрофореза на агарозном геле (электрофореграмма приведена ниже), полосы в котором соответствуют молекулам ДНК. Образцы для электрофореза были получены путем мягкой обработки хроматина ферментом, разрушающим ДНК, с последующим удалением всех белков. Сбоку указаны позиции, до которых перемещаются линейные фрагменты ДНК соответствующего размера. Что на основании этих данных можно сказать о структуре хроматина? Почему полосы ДНК толстые и размытые, а не узкие и концентрированные?

10. Структура ДНК.

Объясните, как частичное раскручивание спирали В-ДНК может облегчить или стабилизировать формирование Z-ДНК.

11. Поддержание структуры ДНК.

(а) Назовите два структурных свойства, необходимых для поддержания отрицательной сверхспирализации молекулы ДНК. (б) Назовите три изменения структуры, которые происходят легче при отрицательной сверхспирализации ДНК. (в) Какой фермент при участии АТР может вносить в ДНК отрицательные супервитки? (г) Опишите физический механизм действия этого фермента.

12. Искусственные хромосомы дрожжей (YAC).

YAC применяются для клонирования крупных участков ДНК в дрожжевых клетках. Какие три типа последовательностей ДНК необходимы для правильной репликации и воспроизведения YAC в дрожжевой клетке?

13. Структура бактериального нуклеоида.

У бактерий транскрипция групп генов зависит от топологии ДНК: при релаксации ДНК экспрессия может усиливаться, но чаще ослабевает. При расщеплении бактериальной хромосомы специфическим ферментом рестрикции (который узнает и расщепляет длинные и, следовательно, редко встречающиеся последовательности) происходит усиление или ослабление экспрессии только расположенных поблизости генов (в пределах 10 000 п. н.). Транскрипция других генов хромосомы не изменяется. Объясните этот факт. (Подсказка. См. рис. 24-37).

14. Топоизомеры ДНК.

При электрофоретическом разделении ДНК в агарозном геле короткие фрагменты движутся быстрее длинных фрагментов. Кольцевые молекулы ДНК одинакового размера, но с разным числом сшивок также можно разделить в агарозном геле: сильно скрученные и, следовательно, более компактные топоизомеры движутся быстрее (сверху вниз на гелях справа). К гелям добавили краситель хлорохин, который встраивается между парами оснований и стабилизирует наиболее слабо скрученные молекулы ДНК. При связывании красителя с релаксированной формой кольцевой ДНК происходит ослабление скрученности ДНК в тех участках, где связался краситель, а в других участках возникают компенсирующие положительные сверхвитки. В представленном здесь эксперименте с помощью топоизомераз готовили образцы одной и той же кольцевой ДНК с разной плотностью сверхспирализации (σ). Полностью релаксированная ДНК мигрировала до положения N (nicked), а сильно скрученная ДНК (за пределом, где можно различить отдельные топоизомеры) — до положения X.

а) Почему в геле А на дорожке с σ = 0 (т. е. в образце ДНК, в котором в среднем σ = 0) видно несколько полос?

б) Отрицательные или положительные сверхвитки несет ДНК в геле В из образца с σ = 0 в присутствии интеркалирующего красителя?

в) В обоих гелях на дорожке с σ = -0,115 видны две полосы: одна соответствует сверхспирали- зованной ДНК, другая — релаксированной ДНК. Объясните присутствие релаксированной ДНК в этом и других образцах.

г) Образец нативной ДНК (крайняя левая дорожка в каждом геле) представляет собой ту же кольцевую ДНК, выделенную из бактериальных клеток, но не обработанную топоизомеразами. Какова приблизительная плотность сверхспирализации этой нативной ДНК?

Анализ экспериментальных данных

15. Функциональные элементы дрожжевых хромосом.

На рис. 24-9 представлены основные структурные элементы хромосом пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Хейтер, Манн, Снайдер и Дэвис (1985) определили свойства некоторых из этих элементов. Их эксперимент был основан на наблюдении, что в клетках дрожжей при митозе плазмиды (содержащие гены и точку начала репликации) ведут себя не так, как хромосомы (содержащие те же элементы, а также центромеры и теломеры). Плазмиды не контролируются митотическим аппаратом и распределяются между дочерними клетками случайным образом. В отсутствие селективного маркера, заставляющего хозяйскую клетку удерживать плазмиды (см. рис. 9-4 вт. 1), они быстро теряются. Напротив, хромосомы контролируются митотическим аппаратом и даже без селективных маркеров утрачиваются крайне редко (с частотой около 10^-5 на одно деление).

Хейтер с коллегами решили выявить наиболее важные элементы дрожжевых хромосом. Для этого они сконструировали плазмиды, содержащие различные части хромосом, и наблюдали за тем, правильно ли осуществляется расхождение этих «синтетических хромосом» при митозе. Для определения количества аномально распределенных хромосом потребовался быстрый метод анализа, позволяющий подсчитывать число копий синтетических хромосом в различных клетках. Они выбрали метод, основанный на том, что колонии дрожжей дикого типа на питательной среде имеют белую окраску, тогда как колонии некоторых нуждающихся в аденине (ade-) мутантов окрашены в красный цвет. В частности, в клетках ade2^-нет функциональной AIR-карбоксилазы (фермент, катализирующий стадию 6а на рис. 22- 33) и в их цитоплазме накапливается AIR (5-аминоимидазолрибонуклеотид). Избыток AIR превращается в красный пигмент. Кроме того, в исследовании использовали ген SUP11, кодирующий охра-супрессор (тип нонсенс-супрессора; см. доп. 27-4), подавляющий проявление фенотипа некоторых ade2 мутантов. Хейтер с соавторами начали с изучения диплоидного штамма дрожжей, гомозиготного по мутации ade2^-; у этих клеток красная окраска. Если эти мутантные клетки несут одну копию SUP11, метаболический дефект частично подавляется, и клетки становятся розовыми. Если в клетке две или более копий SUP11, дефект подавляется полностью, и клетки окрашены в белый цвет.

Исследователи вставляли копию SUP11 в синтетические хромосомы, содержащие различные элементы, которые считались необходимыми для функционирования хромосом, а затем наблюдали за тем, насколько успешно хромосомы передаются от одного поколения к следующему. На неселективные среды высевали розовые клетки и наблюдали за поведением синтетических хромосом. В частности, были обнаружены колонии, в которых синтетические хромосомы распределялись неправильно при первом делении после высева, давая колонии, в которых половина генов относилась к одному типу, а половина — к другому. Поскольку клетки дрожжей неподвижны, колонии были окрашены секторами: половина в один цвет, половина — в другой.

а) Один из механизмов, объясняющих нерасхождение хромосом при митозе, состоит в том, что хромосомы реплицируются, однако сестринские хроматиды не могут разделиться, так что обе копии хромосомы попадают в одну и ту же дочернюю клетку. Объясните, каким образом нерасхождение синтетических хромосом могло бы привести к образованию двухцветных красно-белых колоний.

(б) Другой вариант нарушения митоза — потеря хромосомы, хромосома не входит в ядро дочерней клетки или не реплицируется. Объясните, каким образом потеря синтетической хромосомы могла бы привести к образованию двухцветных красно-розовых колоний.

Подсчет колоний разного типа позволил Хейтеру с соавторами оценить частоту нарушений митоза для различных типов синтетических хромосом. Сначала они попытались установить необходимый размер центромерного фрагмента с помощью синтетических хромосом со вставками ДНК разной длины, содержащими известную центромеру. Результаты эксперимента представлены ниже.

в) На основании представленных данных сделайте заключение о размере центромерного фрагмента, необходимого для нормального расхождения хромосом. Объясните свои рассуждения.

г) Интересно, что все созданные в этих экспериментах синтетические хромосомы были кольцевыми и не содержали теломер. Объясните, каким образом они могли более или менее правильно реплицироваться.

Далее Хейтер с коллегами сконструировали набор линейных синтетических хромосом, содержащих функциональные центромерные последовательности и теломеры, и определяли общее количество нарушений митоза (% потерь хромосомы + % нерасхождений) как функцию размера хромосомы. Результаты эксперимента представлены ниже.

д) На основании этих данных сделайте вывод о размере хромосомы, необходимом для нормального расхождения. Объясните свои рассуждения.

с) Нормальные хромосомы дрожжей линейны, их длина составляет от 250 до 2000 т. п. н., а частота нарушений митоза не превышает 10^-5 на одно клеточное деление. Используя эти данные, ответьте на вопрос: обеспечивали ли использовавшиеся в экспериментах центромерные и теломерные последовательности стабильность митоза нормальных дрожжевых хромосом, или для этого процесса нужны каких-то другие элементы? Объясните свои рассуждения. (Подсказка. Рассмотрите график зависимости логарифма числа ошибок от длины хромосомы.)