Биохимия человека Том 2 - Марри Р. 1993

Биохимия внутри- и межклеточных коммуникаций
Действие гормонов
Механизм действия гормонов II группы (пептидных гормонов) - Действие гормонов, опосредованное кальцием и фосфоинозитидами

Ионизированный кальций служит важнейшим регулятором разнообразных процессов, таких, как мышечное сокращение, сопряжение стимул-секреция, последовательность реакций свертывания крови, активность многих ферментов, возбудимость клеточных мембран. Он является также внутриклеточным посредником действия ряда гормонов.

Метаболизм кальция

Концентрация внеклеточного кальция (Са²⁺) составляет 5 ммоль/л и регулируется очень строго (см. гл. 47). Внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция гораздо ниже — 0,1—10 мкмоль/л, а количество Са²⁺, связанного с внутриклеточными органеллами (митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом), колеблется в пределах 1—20 мкмоль/л. Несмотря на этот 5000—10000-кратный концентрационный градиент и благоприятствующий проникновению Са²⁺ трансмембранный электрический градиент, вход Са²⁺ в клетки резко ограничен. Изменение концентрации Са²⁺ в цитозоле происходит по трем механизмам. Ряд гормонов (класса II. Б) повышает проницаемость мембраны для Са²⁺ и тем самым увеличивает вход в клетку Са²⁺. Это может осуществляться по механизму Na⁺/Ca²⁺-o6MeHa, обладающему большой емкостью, но низким сродством к Са²⁺. Существует также зависимый от АТРазы Са²⁺/2Н⁺-насос, обеспечивающий выведение Са²⁺ из клетки в обмен на Н⁺. Этот механизм характеризуется высоким сродством к Са²⁺, но малой емкостью и, по-видимому, ответствен за тонкую настройку уровня Са²⁺ в цитозоле. Наконец, возможна как мобилизация Са²⁺ митохондрий и эндоплазматического ретикулума, так и накопление Са²⁺ в этих органеллах.

Современные представления о роли Са²⁺ как внутриклеточного посредника в действии гормонов основаны на двух наблюдениях. Во-первых, удалось количественно определить быстрые изменения внутриклеточной концентрации Са²⁺ — такие изменения соответствуют роли внутриклеточного посредника. Эти данные были получены разными методами, в том числе путем использования флуоресцирующих хелаторов Са²⁺ — квин-2 (Quin 2) и фура-2 (Fura 2). С помощью этих соединений можно количественно оценить быстрые изменения концентрации Са²⁺ на субмикромолярном уровне. Второе важное наблюдение, указывающее на связь Са²⁺ с эффектом гормонов, состояло в определении внутриклеточных мишеней действия этого иона: был обнаружен Са²⁺-зависимый регулятор фосфодиэстеразной активности, и это послужило основой для понимания того, каким образом Са²⁺ и сАМР взаимодействуют внутри клетки.

Кальмодулин

Кальций-зависимый регуляторный белок назван кальмодулином; его мол. масса 17000, по структуре и функции он гомологичен мышечному белку тропонину С. Кальмодулин содержит четыре участка связывания Са²⁺. Связывание Са²⁺ по всем четырем участкам ведет к заметному изменению конформации белка: большая часть молекулы приобретает структуру а-спирали. Эти конформационные переходы определяют, видимо, способность кальмодулина активировать или инактивировать определенные ферменты. Взаимодействие ионов кальция с кальмодулином (и соответствующее изменение активности последнего) в принципе сходно с процессом связывания сАМР с протеинкиназой, обеспечивающим активацию этого фермента. Кальмодулин часто оказывается одной из многочисленных субъединиц сложных белков и, как правило, участвует в регуляции активности различных киназ, а также ферментов синтеза и распада циклических нуклеотидов. Список некоторых ферментов, прямо или косвенно (по-видимому, через кальмодулин) регулируемых Са²⁺, приведен в табл. 44.5.

Са²⁺-кальмодулин оказывает регуляторное влияние не только на активность ферментов и транспорт ионов, но и на функционирование многих структурных элементов в клетке. К числу последних относится актинмиозиновый комплекс гладких мыщц, находящийся под ß-адренергическим контролем, а в неконтрактильных клетках — микрофиламенты, опосредующие такие процессы, как клеточная подвижность, изменение формы клеток, митоз, высвобождение гранул, эндоцитоз.

Таблица 44.5. Ферменты, регулируемые комплексом кальций-кальмодулин

Кальций как медиатор действия гормонов

Роль ионизированного кальция в действии гормонов доказывается следующими наблюдениями: эффект многих гормонов 1) исчезает в бескальциевой среде или при истощении внутриклеточных запасов Са²⁺; 2) может быть имитирован с помощью агентов, увеличивающих концентрацию Са²⁺ в цитозоле, например Са²⁺-ионофора А23187; 3) сопряжен с транспортом Са²⁺ в клетку. Все эти явления были довольно подробно изучены на клетках гипофиза, гладких мышц, слюнных желез и на тромбоцитах; наиболее полно исследован механизм регуляции метаболизма гликогена в печени вазопрессином и X- адренергическими катехоламинами. Указанный механизм схематически представлен на рис. 19.5 и 19.7.

Добавление а₁-агонистов или вазопрессина к изолированным гепатоцитам уже через несколько секунд вызывает 3-кратное увеличение содержания Са²⁺ в цитозоле (с 0,2 до 0,6 мкмоль/л). Это увеличение предшествует такому же возрастанию активности фосфорилазы; изучение каждого из указанных эффектов показало, что они наблюдаются при сопоставимых концентрациях гормона, а₁-Антагонисты ингибируют повышение Са²⁺ в цитозоле; удаление гормона приводит к быстрому снижению как концентрации Са²⁺ в цитозоле, так и количества фосфорилазы а. Первоначально Са²⁺ поступает, очевидно, из клеточных органелл, причем запасенного в них Са²⁺, видимо, достаточно для того, чтобы мог проявиться немедленный эффект гормона. Для более продолжительного действия необходим либо вход Са²⁺ в клетку, либо торможение его выхода, осуществляемого Са²⁺-насосом. Последний процесс зависит от происходящего одновременно возрастания концентрации сАМР.

Активация фосфорилазы происходит путем превращения фосфорилазы b в фосфорилазу а под действием фермента киназы фосфорилазы b. В состав этого фермента (в качестве его 5-субъединицы) входит кальмодулин, и активность фермента возрастает при увеличении концентрации Са²⁺ в пределах 0,1—1 мкмоль/л, т. е. в тех же пределах, в каких содержание ионов кальция в цитозоле печени повышается в присутствии гормона. Связь между Са²⁺ и активацией фосфорилазы совершенно определенна.

С помощью Са²⁺ или путем фосфорилирования или обоими способами одновременно осуществляется регуляция целого ряда ключевых ферментов метаболизма; к их числу относятся гликогенсинтаза, глицерол-3-фосфат — дегидрогеназа, пируватдегидрогеназа, пируваткиназа и пируваткарбоксилаза. Остается не ясным, прямо ли участвует в этой регуляции кальмодулин или же основная роль принадлежит недавно открытым протеинкиназам (Са²⁺/кальмодулин-зависимой либо Са²⁺/фосфолипид-зависимой).

Роль продуктов превращения фосфоинозитидов в Са²⁺-зависимом действии гормонов

Очевидно, что коммуникация между рецептором гормона на плазматической мембране и внутриклеточными резервуарами Са²⁺ должна осуществляться с помощью какого-то сигнала. Наиболее вероятные кандидаты на роль такого сигнала — продукты превращения фосфоинозитидов. Фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат под действием фосфолипазы С гидролизуется до мноннозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола (рис. 44.5). В гепатоцитах эта реакция наблюдается через несколько секунд после добавления вазопрессина или адреналина. Как показано на различных препаратах мембран и целых органелл, миоинозитол-P3 в концентрациях 0,1—0,4 мкмоль/л вызывает очень быстрое высвобождение Са²⁺. Попытки воспроизвести действие гормона посредством этого соединения (а это важный этап установления взаимосвязи между ними) были не совсем успешными, вероятно потому, что трудно добиться проникновения миоинозитола-Р₃ в клетку, а внутри клетки он очень быстро гидролизуется. Другой продукт гидролиза фосфоинозитида—1,2-диацилглицерол — активирует Са²⁺-фосфолипид-зависимую протеинкиназу за счет увеличения Км-фермента по отношению к Са²⁺. Вопрос о том, какую роль играет этот процесс в действии Са²⁺-зависимых гормонов, в настоящее время исследуется.

Действие стероидогенных агентов, в том числе АКТГ и сАМР в коре надпочечников; ангиотензина II, К⁺, серотонина, АКТГ и дибутирил-сАМР в клубочковой зоне надпочечников; ЛГ в яичниках; ЛГ и сАМР в клетках Лейдига (в семенниках), сопряжено с возрастанием концентраций фосфатидной кислоты, фосфоинозитола и полифосфоинозитидов в соответствующих тканях-мишенях.

Можно привести еще несколько примеров. Так, через 5—10 с после добавления ТРГ к клетках гипофиза в них заметно возрастает расщепление фосфоинозитидов фосфолипазой С; при этом повышается уровень инозитолди- и трифосфатов в клетках и в результате происходит мобилизация внутриклеточного кальция. Это ведет к активации Са²⁺-зависимой протеинкиназы, которая в свою очередь фосфорилирует ряд белков (один из них, вероятно, участвует в высвобождении ТСГ). Кальций, по-видимому, служит также внутриклеточным медиатором действия ГнРГ на высвобождение ЛГ. Полагают, что в этом процессе участвует также кальмодулин.

Роль кальция и продуктов расщепления полифосфоинозитидов в действии гормонов представлена на рис. 44.5. Как видно из схемы, продукты гидролиза фосфоинозитидов служат вторыми посредниками, а Са²⁺ — фактически третьим посредником. Схему можно было бы дополнить тем, что в сопряжении событий, происходящих на мембране, с высвобождением Са²⁺ участвует, возможно, G-белок. Такая сложнейшая сеть внутриклеточных посредников, по-видимому, не уникальное явление.