Биохимия аминокислот - А. Майстер 1961
Общая биохимия и физиология аминокислотного обмена
Перенос аминокислот в клетке
Внутриклеточному обмену аминокислот, естественно, должен предшествовать их перенос через клеточную мембрану. Механизмы, обеспечивающие этот процесс, еще не выяснены, хотя и исследован ряд участвующих в нем факторов. Для изучения процесса поглощения аминокислот используются различные экспериментальные модели: препараты кишечника, тканевые срезы, эритроциты, свободные клетки опухолей, суспензии бактерий. Один из применяемых для этих целей экспериментальных приемов состоит в инкубировании изолированных клеток в среде, содержащей аминокислоты, и в определении начальной и конечной концентраций аминокислот в растворе и в клетках. Другой способ заключается в определении аминокислоты, появляющейся в растворе, омывающем серозную поверхность петли кишечника, в которую введен раствор аминокислот.
Из имеющихся в настоящее время данных следует, что аминокислоты могут проникать в клетки как путем простой диффузии, так и в результате активного процесса, при помощи которого они концентрируются внутри клеток. Наличие активного переноса подтверждается данными опытов, показавших, что внутриклеточная концентрация аминокислот значительно превышает концентрацию их во внеклеточной жидкости, а также, что L-изомеры аминокислот проникают в клетки значительно быстрее, чем соответствующие им D-изомеры. Перенос определенной аминокислоты в клетки разных типов может осуществляться неодинаковыми механизмами; наряду с этим у клеток одного типа механизм поглощения разных аминокислот может быть различным. Явление концентрирования аминокислот играет существенную роль при всасывании аминокислот из пищеварительного канала, при их реабсорбции в почках и при переносе аминокислот из материнской крови в кровь плода [1].
Получены убедительные данные, подтверждающие способность клеток организма млекопитающих концентрировать аминокислоты. Концентрация аминокислот в тканях значительно выше, чем в жидкостях тела [2]. Аминокислоты, введенные в пищеварительный канал или в кровяное русло, быстро удаляются из крови и накапливаются в тканях. Ван-Слайк и Мейер [3] уже давно пришли к выводу, что высокую концентрацию аминокислот в тканях нельзя объяснить простой диффузией; эти авторы высказали предположение о возможных механизмах переноса, связанных с адсорбцией аминокислот или с образованием непрочных молекулярных соединений между аминокислотами и белками. В 1912 г. Ван-Слайк и Мейер писали, что «обсуждение этого вопроса в настоящее время преждевременно». Хотя за 45 лет, истекших с того времени, появилось много экспериментальных работ, посвященных проблеме переноса аминокислот, до сих пор нельзя прийти к окончательному заключению относительно механизма этого процесса.
По-видимому, большая часть белков пищи подвергается в пищеварительном канале гидролизу на составляющие их аминокислоты, и, следовательно, аминокислоты всасываются из кишечника преимущественно, если не исключительно, в свободном виде. Не существует данных, полностью исключающих возможность того, что некоторые белки могут всасываться как таковые.
Данные, свидетельствующие о всасывании яичного белка через грудной лимфатический проток, получены при помощи иммунологических методов [4]. Фишер [5] и некоторые другие авторы считают, что аминокислоты могут всасываться в виде пептидов; возможно, что всасывание пептидов в небольших количествах действительно имеет место (стр. 483). Концентрация пептидов в плазме крови крайне незначительна [2], однако это не позволяет исключить участие пептидов или ациламинокислот в процессе всасывания.
Процессу всасывания аминокислот в кишечнике посвящен ряд исследований. В опытах на интактных животных было показано, что содержание аминного азота в крови быстро нарастает после приема отдельных аминокислот (например, глутаминовой кислоты, лейцина) [6, 7]. В некоторых исследованиях [8—10] получены данные, согласующиеся с механизмом всасывания путем простой диффузии, однако очевидно, что существует и механизм активного всасывания. Так, было найдено, что всасывание аланина, глицина и валина не пропорционально концентрации этих аминокислот в просвете кишечника [11]. Далее, установлено, что при внесении растворов DL-аминокислот в изолированную петлю тонкого кишечника крысы L-изомеры аминокислот поглощаются со значительно большей скоростью, чем соответствующие D-изомеры [12]. В других опытах с препаратами тонких кишок также было отмечено более быстрое всасывание L-аминокислот по сравнению с их D-изомерами [13—20]. Так, например, после внесения рацемического аланина
в петлю тонкого кишечника кошки венозная кровь, оттекающая от петли, богаче L-аланином, чем D-аланином [14, 15]; такие же результаты были получены с рацемическим фенилаланином и лейцином [13]. В исследованиях этого рода показано также, что L-глутаминовая и L-аспарагиновая кислоты не поглощаются из кишечника против градиента концентрации [17].
В опытах in vitro, при которых изолированные отрезки тонкой кишки погружали в суспензионную жидкость [21], было найдено, что L-гистидин и L-фенилаланин в противоположность D-изомерам этих аминокислот переносятся через стенку кишечника против градиента концентрации. L-Глутаминовая кислота переносится с такой же скоростью, что и вода, в которой она растворена [19]. Перенос аминокислот против градиента концентрации тормозится цианидом и 2,4-динитрофенолом; в присутствии этих ингибиторов скорость всасывания L-изомеров была приблизительно равна скорости всасывания D-изомеров [20]. В опытах с изолированным отрезком тонкой кишки морской свинки L-изомеры гистидина и аланина переносились из просвета кишечника в раствор, омывающий серозную поверхность, значительно быстрее, чем соответствующие D-изомеры; перенос L-аминокислот был заторможен в анаэробных условиях, а также в присутствии 2,4-динитрофенола.
Флоридзин не оказывает влияния на активное всасывание L-аминокислот [18]. Еще ранее было отмечено, что у крыс, получавших флоридзин, всасывание глицина и аланина происходило быстрее, чем в нормальных условиях, тогда как всасывание глюкозы было нарушено [22]. Найдено, что 4-дезоксипиридоксин тормозит всасывание DL-аланина из препаратов кишечника морской свинки [18], а также, подобно 2,4-динитрофенолу, тормозит поглощение глюкозы и фруктозы [23]. Совокупность имеющихся данных указывает на зависимость механизма всасывания от сохранности дыхания, и на возможную связь его с процессами фосфорилирования. Тот факт, что флоридзин тормозит всасывание сахаров, но не подавляет всасывание аминокислот, свидетельствует о том, что поглощение аминокислот и сахаров осуществляется при помощи различных механизмов. Тормозящее влияние 4-дезоксипиридоксина указывает на возможное участие витамина В6 в процессе всасывания аминокислот; с этим предположением согласуются также данные других исследований (стр. 169). Опыты, касающиеся всасывания аминокислот препаратами кишечника, показали, что всасывание аминокислот не задерживается в присутствии глюкозы, за исключением тех случаев, когда концентрация последней очень высока; эти данные вновь подтверждают наличие разных механизмов всасывания для аминокислот и сахаров. Заслуживает внимания, что глутамин всасывается нерасщепленным и притом значительно быстрее, чем глутаминовая кислота. Аспарагин также всасывается быстрее, чем аспарагиновая кислота, однако он в процессе всасывания подвергается гидролизу [18]. Эти данные созвучны с результатами других исследований, согласно которым глутамин проникает в различные ткани, в особенности в ткань мозга, значительно быстрее, чем глутаминовая кислота (стр. 174).
Поглощение аминокислот наблюдали и в других экспериментальных системах. Так, например, было найдено, что срезы коры головного мозга морской свинки накапливают L-глутаминовую кислоту против градиента концентрации [24]. L-Глутамин поглощался корой головного мозга значительно быстрее, однако конечные концентрации аминокислоты в ткани в опытах с глутаминовой кислотой и глутамином были примерно одинаковы. В опытах с глутаминовой кислотой нарастание ее концентрации в ткани прекращалось, когда разность между концентрациями кислоты в ткани и в окружающей среде составляла около 0,02 М. Эритроциты человека и утки, а также ретикулоциты кролика способны концентрировать аминокислоты. Активность ретикулоцитов кролика подавляется 2,4-динитрофенолом и цианидом; на концентрирование аминокислот эритроцитами человека и утки эти агенты почти не оказывают влияния [25, 26].
Изолированная диафрагма крысы накапливает глицин; этот процесс чувствителен к действию цианида и 2,4-динитрофенола [27, 28]. Активное поглощение глицина тканями наблюдали также в опытах in vivo на морских свинках при кормлении их глицином [29—31]. Количество поглощаемого тканями глицина снижалось, если животным одновременно с глицином давали другие аминокислоты; эти данные указывают на существование конкурентных соотношений между аминокислотами в процессе их переноса. Есть основание предполагать, что многие аминокислоты концентрируются в тканях посредством одного и того же механизма.
Кристенсен и сотрудники [32—35] применили для изучения переноса аминокислот удачный экспериментальный объект. Эти исследователи обнаружили, что свободные клетки мышиной карциномы Эрлиха поглощают аминокислоты активнее, чем клетки большинства других тканей млекопитающих. При подходящих условиях градиенты концентрации глицина между клетками опухоли и суспензионной средой превышали 60 ммолей на 1 л воды. Активное концентрирование аминокислот тормозилось в условиях анаэробиоза, а также под влиянием цианида, арсената, 2,4-динитрофенола, малоната, ауреомицина и хлоромицетина. Поглощению глицина сопутствовали выход ионов калия из клеток и поступление в них воды и ионов натрия [32].
При интерпретации данных, относящихся к процессу переноса аминокислот, большое значение приобретает вопрос о состоянии аминокислот внутри клетки. Вполне очевидно, что поглощение той или иной аминокислоты клеткой может зависеть от концентрации аминокислоты в окружающей жидкости, от активности системы, переносящей аминокислоту в клетку, и от превращений, которым аминокислота подвергается в реакциях клеточного обмена. Различными способами удается извлечь из клеток свободные аминокислоты; однако не исключено, что в неповрежденных клетках они находятся в связанной форме. Соответствующие связи могут быть сравнительно нестойкими и способными распадаться даже при мягких условиях экстракции. Между тем данные исследований Кристенсена [32—34] и Гайнца [35] указывают на то, что легко экстрагируемые из клеток аминокислоты существуют в клетках в виде свободных аминокислот. Для удержания глицина в тех высоких концентрациях, в которых он поглощается клетками асцитной опухоли, потребовались бы столь же высокие концентрации связывающего агента; данных, указывающих на наличие подобного агента, до сих пор не получено. Наблюдения, показавшие, что вместе с аминокислотами в клетки поступает вода, также говорят в пользу присутствия в клетках свободных аминокислот. В опытах со свободными раковыми клетками наблюдалась прямая зависимость между градиентом концентрации глицина и увеличением содержания воды в клетках (осмотический эффект). Гайнц [35] в опытах на клетках асцитной опухоли исследовал кинетику поступления и выхода глицина в процессе переноса и нашел, что зависимость между скоростью притока глицина в клетки и концентрацией глицина в среде можно описать уравнением Михаэлиса — Ментена. Скорость поступления глицина не снижается и даже возрастает при предварительном насыщении клеток глицином. Автор приходит к выводу, что фактором, ограничивающим скорость поглощения глицина, служит связывание глицина с каким-то компонентом клеточной стенки. Полученные им результаты согласуются с представлением о наличии глицина в клетках в свободном состоянии и указывают на то, что выход глицина происходит главным образом путем диффузии.
Природа первичного акта связывания аминокислот, на существование которого указывают данные кинетики, не известна. Данные, согласно которым пиридоксаль стимулирует накопление аминокислот клетками мышиной карциномы, свидетельствуют о возможном участии витамина В6 в этом процессе [36]. Асцитные клетки, полученные от В6-авитаминозных мышей, отличаются более слабой активностью переноса аминокислот от клеток опухоли, развившейся у контрольных мышей. Хотя эти наблюдения дают основание предполагать, что витамин В6 принимает участие в процессе переноса аминокислот, было найдено, что пиридоксальфосфат менее активен, чем свободный пиридоксаль. Помимо того, оказалось, что 4-нитросалицил- альдегид в такой же степени стимулирует поглощение аминокислот, как и пиридоксаль [37].
Кристенсен и его сотрудники [34, 38—42, 696—698] исследовали накопление целого ряда аминокислот клетками мышиной карциномы. Было обнаружено, что в клетках мышиной карциномы концентрируются как L-, так и D-изомеры аминокислот, причем L-изомеры — более активно. Как правило, с удлинением боковой цепи перенос аминокислот затрудняется; аминокислоты, обладающие электроноакцепторными заместителями (например, орнитин, метионин, оксипролин), концентрируются клетками более активно. Присутствие метильной группы в а-положении повышает интенсивность накопления, тогда как наличие в молекуле второй карбоксильной группы обычно ее снижает. Диаминокислоты, например орнитин, лизин, а,у-диаминомасляная кислота и а,β-диаминопропионовая кислота, концентрируются в клетках легче, чем соответствующие моноаминокислоты. Полученные данные согласуются с представлением, по которому реакции переноса протекают значительно легче, если аминогруппа находится в незаряженной форме, т. е. в той форме, которая легко реагирует с образованием ацильных производных или шиффовых оснований. Кристенсен выдвигает предположение о возможности образования шиффовых оснований как промежуточного этапа в механизме переноса аминокислот. Из участия а-метиламинокислот в таких реакциях можно заключить, что наличие а-водородного атома несущественно для переноса; возможно, что отсутствие а-водородного атома повышает стабильность промежуточного шиффова основания. Быстрое поглощение диаминокислот также свидетельствует в пользу того, что они вступают с пиридоксалем в стабильные промежуточные комплексы типа шиффовых оснований [34]. Было также найдено, что отсутствие свободной карбоксильной группы или ацилирование аминогруппы снижает или полностью подавляет накопление данной аминокислоты клетками.
Поглощение аминокислот бактериальными клетками было исследовано у целого ряда видов. Механизм этого процесса у бактерий существенно отличается от механизма его в клетках млекопитающих; резкие различия наблюдаются также между отдельными видами микроорганизмов. Исследование поглощения аминокислот бактериями осложняется наличием одновременно протекающих превращений аминокислот в клетках, в том числе реакций распада аминокислот и реакций, ведущих к синтезу белка. Исследования, проведенные Робертсом и его сотрудниками [43] на Escherichia coli, показывают, что клеточная мембрана этого микроорганизма легко проницаема для многих соединений. По мнению этих авторов, единственным механизмом, посредством которого у Е. coli осуществляется поглощение аминокислот и других веществ, является простая диффузия, причем компоненты среды свободно диффундируют в «водное пространство» клетки. Поэтому в «водном пространстве» и в окружающей среде должна устанавливаться одинаковая концентрация веществ. В опытах по измерению объема «водного пространства» путем приведения клеток в равновесие с растворами различных меченных изотопами соединений (в том числе и аминокислот) с последующим анализом отцентрифугированных клеток и надосадочной жидкости были получены приблизительно одни и те же величины. Из этих опытов следует, что концентрации способных диффундировать веществ в клетках Е. coli и в окружающей среде примерно одинаковы, за исключением тех случаев, когда эти вещества связываются в клетке или используются в процессах обмена.
Наряду с этим имеются противоположные данные, согласно которым Е. coli и некоторые другие микроорганизмы способны накапливать аминокислоты против градиента концентрации. Так, например, Гейл и Родуэлл [44] обнаружили, что клетки Streptococcus faecalis, суспендированные в растворах лизина, накапливают лизин; в этих условиях концентрация лизина внутри клеток достигает значительно более высокого уровня, чем в окружающей жидкости. Эти результаты как будто свидетельствовали о наличии процесса активного поглощения лизина клетками. Однако было найдено, что при определенных экспериментальных условиях лизин может свободно проникать в клетки Str. faecalis и выходить из них [45, 46]. Авторы пришли к выводу, что наблюдаемые явления можно объяснить на основе известных физических закономерностей, которым подчиняется распределение вещества по обе стороны полупроницаемой мембраны.
Возможно, что у Е. coli происходит какой-то процесс фиксации накапливаемых аминокислот, предшествующий их включению в белки [47]. При инкубировании Е. coli в среде, содержащей С14-валин, концентрация валина в клетках достигала величин, в 1000 раз превышающих концентрацию его в среде. Поглощенный валин удавалось конкурентно вытеснить лейцином или изолейцином. Процесс поглощения был специфичен для L-валина и протекал значительно быстрее, чем включение этой аминокислоты в белки. Хотя природа процесса фиксации осталась невыясненной, было высказано предположение, что в клетках Е. coli имеются специфические акцепторы для аминокислот.
Гейлом и его сотрудниками [45, 46, 48, 49] было изучено также накопление глутаминовой кислоты клетками Streptococcus faecalis и Staphylococcus aureus. Как и в опытах, касающихся поглощения лизина, были получены данные, согласно которым глутаминовая кислота может легко перемещаться между «водным пространством» клеток и окружающей средой. Однако в присутствии глюкозы имеет место накопление глутаминовой кислоты в клетках. Совершенно очевидно, что для выяснения этого вопроса необходимо преодолеть ряд экспериментальных трудностей; некоторые из них были подробно рассмотрены Гейлом [45] и Кристенсеном [34].