Биохимия аминокислот - А. Майстер 1961
Общая биохимия и физиология аминокислотного обмена
Рацемизация аминокислот
Рацемизация аланина
В противовес данным, полученным в опытах на животных, установлено, что для микроорганизма Streptococcus faecalis D-изомер аланина в определенных условиях является специфическим фактором роста; ни L-аланин, ни пировиноградная кислота не могут заменить D-аланин [363—365]. Этот факт в свое время стоял особняком как единственный случай, когда D-аминокислота оказалась необходимой для роста организма. Позднее было установлено, что небольшие количества витамина В6 заменяют D-аланин, причем было показано, что клетки S. faecalis при росте на среде, содержащей D-аланин, не синтезируют витамин В6. Эти данные позволили установить, что витамин В6 необходим для образования D-аланина, а не наоборот.
Вуд и Ганселус [366], изучая пути биосинтеза D-аланина в клетках S. faeccilis, обнаружили у этого микроорганизма наличие ферментной системы, катализирующей образование рацемического аланина как из D-, так и из L-изомера. Этот фермент, названный аланинрацемазой, был найден затем в клетках других микроорганизмов, в том числе у Leuconostoc mesenteroides, Escherichia coli, Bacillus subtllis и Pseudomonas fluorescens. Частично очищенный препарат аланинрацемазы был получен из экстрактов 5. faecalis. Установлено, что добавление пиридоксальфосфата значительно активирует очищенный фермент, тогда как пиридоксаминфосфат подобного действия не оказывает. Пировиноградная кислота в ходе реакции рацемизации не образуется. Скорость ферментативного превращения каждого из оптических изомеров аланина в рацемат одинакова. Фермент строго специфически катализирует реакцию рацемизации аланина; другие аминокислоты, например а-аминомасляная кислота, цистеин, серин, лейцин, треонин, пролин, оксипролин, лизин, аргинин, гистидин, тирозин, триптофан, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, не подвергаются рацемизации. Все данные говорят о том, что рацемизация аланина осуществляется посредством прямой реакции, без промежуточного образования а-кетокислоты (пировиноградной кислоты). Участие витамина В6 в действии рацемазы послужило поводом к изучению неферментативных реакций рацемизации с участием пиридоксаля. Эти исследования привели к выводу, что механизм реакции рацемизации заключается в образовании шиффова основания из пиридоксаля и аминокислоты; при обратимых таутомерных превращениях этого промежуточного комплекса временно возникает двойная связь между а-углеродным атомом и азотом аминогруппы (стр. 256).
Аланинрацемаза, присутствующая в спорах Bacillus terminalis, интересна в том отношении, что этот фермент отличается значительной термостабильностью [367]. Аланинрацемаза вегетативных клеток этого микроорганизма полностью разрушается при нагревании в течение 15 мин. до 80°, тогда как в спорах одноименный фермент после 2-часового нагревания при той же температуре теряет лишь 10% активности. В экстрактах из спор, разрушенных ультразвуком, аланинрацемаза также термостабильна. Только после переведения фермента в растворимое состояние при помощи дальнейшего озвучивания он утрачивает свою устойчивость к нагреванию. Из этих наблюдений следует, что в спорах рацемаза стабилизирована в результате связывания с нерастворимыми структурами; возможно, что и другие ферменты стабилизируются подобным же образом. Изучение этого явления представляет интерес не только для понимания устойчивости спор к действию высокой температуры, но и в связи с проблемой термотолерантных бактерий.
В результате осуществляемого аланинрацемазой взаимопревращения D- и L-аланина клетка располагает обоими этими изомерами. Хотя основное внимание привлекла роль рацемазы в образовании D-аланина, возможны ситуации, при которых рацемаза катализирует образование необходимого для роста L-аланина. В клетках Bacillus subtilis и некоторых других организмов, синтезирующих внеклеточную полиглутаминовую кислоту преимущественно D-конфигурации, D-аминокислоты образуются исключительно под действием аланинрацемазы. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в клетках этих бактерий из L-аланина под действием аланинрацемазы образуется D-аланин. Далее путем переаминирований между D-аланином и а-кетоглутаровой кислотой образуется D-глутаминовая кислота (стр. 228), которая превращается затем в полиглутаминовую кислоту (стр. 265). Весьма любопытно, что эти бактерии, столь нуждающиеся в D-глутаминовой кислоте, не располагают рацемазой глутаминовой кислоты.
Культуры Streptococcus faecalis удается выращивать в таких условиях, при которых единственным фактором, лимитирующим скорость роста, служит наличие в питательной среде либо витамина В6, либо D-аланина. Можно с полным основанием принять, что в данных условиях функция витамина В6 сводится исключительно к его участию в синтезе D-аланина [368]. В этой системе активность ω-метилпиридоксаля, добавленного к среде в качестве фактора роста, составляет 3—6% ростовой активности пиридоксаля. В соответствии с этими фактами было найдено, что ω-метилпиридоксальфосфат может функционировать в роли коферменте в опытах с препаратом частично очищенной аланинрацемазы, полученной из клеток S. faecalis. Однако сродство фермента к пиридоксальфосфату в 10 раз выше, чем к ω-метилпиридоксальфосфату. Предварительное инкубирование фермента с 4-дезоксипиридоксинфосфатом препятствует его последующей активации при добавлении пиридоксальфосфата. Если же аланинрацемазу сначала инкубировать с пиридоксальфосфатом в концентрации, достаточной для насыщения апоферменти, то последующее добавление 4-дезоксипиридоксинфосфата не угнетает действия рацемазы. Аналогичные наблюдения имеются также в отношении тирозиндекарбоксилазы S. faecalis [369] и аспартат-глутамат-трансаминазы сердца свиньи (стр. 252). По-видимому, коферменты, содержащие витамин В6, как правило, прочно связаны с апоферментом. Возможно, что эти связи являются ковалентными; природа их подлежит изучению.