Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980
Свет в биологии
Флуоресценция и фосфоресценция
Внутримолекулярный перенос энергии
Нередко электронное возбуждение одного хромофора вызывает флуоресценцию другого хромофора, расположенного поблизости. Так, например, возбуждение молекул красителя, образующих монослой, приводит к флуоресценции слоя другого красителя, находящегося от первого на расстоянии 5 нм. Возбуждение остатков тирозина в белках может вызвать флуоресценцию триптофана, а возбуждение триптофана — флуоресценцию красителя, связанного с поверхностью молекулы белка, или флуоресценцию связанного кофермента [57]. Такого рода резонансный перенос энергии характерен для тех случаев, когда спектр флуоресценции одной молекулы перекрывается со спектром поглощения другой. При этом реального испускания и поглощения света не происходит, а имеет место безызлучательный перенос энергии. Резонансный перенос энергии имеет большое биологическое значение для фотосинтеза. Поскольку молекула с ε = 3∙104 при воздействии прямого солнечного света поглощает около 12 квантов света в секунду, ионо- молекулярный слой хлорофилла будет поглощать всего 1 % общего числа квантов, падающих на поверхность листа [63]. По этой причине молекулы хлорофилла располагаются в виде многочисленных тонких слоев внутри хлоропластов. Однако непосредственно в реакционных центрах, где идут фотохимические процессы, находится лишь небольшое число специализированных молекул хлорофилла. Остальные молекулы поглощают свет и передают энергию в реакционный центр небольшими порциями.
Как подсчитал Фёрстер [63а], константа скорости переноса энергии kt пропорциональна константе скорости флуоресценции kf, геометрическому фактору К2, площади перекрывания спектров J и обратно пропорциональна четвертой степени показателя преломления и шестой степени расстояния r между хромофорами:
Фёрстер не только предсказал характер зависимости константы скорости переноса энергии от r, но и предложил формулу для расчета расстояния R0 между хромофорами, при котором синглет-синглетный перенос энергии происходит с 50%-ной эффективностью. Обычно R0 имеет порядок 2,0 нм. Используя эти соотношения, Страйер предложил метод измерения расстояния между хромофорами. Он провел калибровку метода, использовав семейство молекул, содержащих жесткую тройную полипролиновую спираль различной длины, к которой с одного конца присоединена дансильная группа (гл. 2, разд. 3,4), а с другой — нафтильная [64 ,65]. Если происходит перенос энергии, то, возбуждая нафтильные группы, имеющие полосы поглощения в высокоэнергетической области, можно наблюдать флуоресценцию с максимумом при больших длинах волн, характерную для дансильных групп. Поскольку спектр флуоресценции нафтильной группы перекрывается со спектром поглощения дансильной группы, эффективность такого переноса энергии должна быть достаточно высокой. Полученная зависимость эффективности переноса от расстояния представлена на рис. 13-17. Обратите внимание, насколько хорошо выполняется пропорциональность эффективности переноса r-6; при этом R0 = 3,4 нм. Проведя такую «спектроскопическую» калибровку, Страйер обратился далее к биохимическим макромолекулам. Присоединяя флуоресцентные зонды к родопсину, являющемуся рецептором видимого света, By и Страйер смогли оценить расстояния между специфическими участками молекулы, что позволило им сделать некоторые заключения относительно общей формы молекулы!
При введении тербия(III) в кальцийсвязывающий центр термолизина (гл. 7, разд. Г, 4) наблюдалась флуоресценция, обусловленная переносом энергии от иона кобальта (II), находящегося в центре связывания цинка. С помощью уравнения Фёрстера было получено расстояние между Са2+ и Zn2+, равное 1,37 нм, что согласуется с результатами рентгеноструктурного исследования этого фермента [66]
РИС. 13-17. Эффективность переноса энергии в зависимости от расстояния между сенафтильной и дансильной группами, расположенными на концах полипролильного «стержня» (L-пролил)n [64]. Точки указывают значения эффективности при n от 1 до 12. Кривая есть графическое представление функции, пропорциональной r-6.