Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Хроматография
Метод тонкослойной хроматографии

В методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) используют твердую стационарную фазу нанесенную (и часто закрепленную) на пластине-подложке (стеклянной, пластмассовой, алюминиевой). В качестве твердой фазы используют силикагели, окислы алюминия, ионообменные смолы (чаще всего модифицированные целлюлозы) или носитель для гель-фильтрации (пористый гель, например полиакриламид). Методически ТСХ выполняется так же как и БХ.

Методы бумажной и ТСХ применимы для анализа практически любых смесей. Их достоинства: простота, высокие разрешающая способность и воспроизводимость, малое время анализа (20 мин. - 3 часа), высокая чувствительность (очень малый расход анализируемого образца).

Методы детектирования аминокислот

Методы детектирования и количественного определения аминокислот после разделения методами БХ и ТСХ одинаковы. Хроматограммы опрыскивают 0.5% раствором нингидрина в ацетоне, просушивают и прогревают 30 мин. при Т=75°С. Аминокислоты проявляются в виде синих пятен. Эти пятна вырезают. Окрашенный комплекс аминокислот с нингидрином экстрагируют спиртовым раствором сернокислой меди и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 575 нм. По калибровочным кривым для соответствующих аминокислот определяют их количества.

Некоторые аминокислоты можно анализировать (идентифицировать) после хроматографирования использую специфические для них реакции (см. разд. 1.1.7; 1.1.8). Так, например, гистидин и тирозин можно обнаружить, обработав хроматограмму диазотированной сульфаниловой кислотой в щелочной среде. Пятна гистидина и тирозина окрашиваются в красный и бурый цвета соответственно. Пролин и оксипролин дают интенсивную синюю окраску при дополнительной обработке хроматограмм после нингидрина перекисью водорода. Пятна для всех остальных аминокислот при этом обесцвечиваются.