Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Электронная микроскопия
Подготовка и “окрашивание” образцов

Подготовка образца для анализа методом электронной микроскопии весьма ответственная часть эксперимента и включает несколько стадий. Биологические препараты готовятся в следующей последовательности.

> На первой стадии проводят операцию фиксации - вымачивания в растворе, например, глутарового альдегида.

> Высушивание.

> Заливка в пластмассовый блок.

> Нарезка тонких слоев залитого в блок образца с помощью стеклянного или алмазного ножа, либо ультрамикротома.

“Окрашивание”. В электронной микроскопии биологических образцов применяют, в основном, два типа “окрашивания” - позитивное и негативное. При позитивном, молекулы красителя присоединяются к различным участкам макромолекулы. При негативном (негативное контрастирование) макромолекулы заключают в тонкую пленку красителя. В качестве красителя используют соли тяжелых металлов.

При окрашивании образуются области с различной электронной плотностью, что и позволяет выявлять особенности рельефа образца (см.рис.ниже)

При позитивном контрастировании образец окрашивают в растворе и помещают на сеточку. При негативном - каплю раствора с образцом наносят на покрытую углеродной пленкой медную сеточку. Молекулы образца быстро адсорбируются пленкой (1-2 мин), после чего жидкость аккуратно удаляют и наносят каплю раствора “красителя”. Через 15-20 с раствор с контрастом удаляют и сушат образец на воздухе.