Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы очистки белков
Оценка полноты очистки и гомогенности белков

Заключения о чистоте выделенного белка требуют знаний о наличии в нем белковых и небелковых примесей. Полнота очистки от небелковых азотсодержащих соединений оценивается обычно по соотношению между белковым (осаждаемым 10% ТХУ) и общим азотом препарата.

Оценить наличие белковых примесей в образце значительно труднее. Как правило, надежное заключение можно получить только путем сочетания различных методов. Это наиболее эффективные варианты методов ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, молекулярной (гель-)фильтрации и т.д. По мере совершенствования экспериментальных методов степень достоверности выводов о чистоте данного белка возрастает. Однако, как ранее, так и сейчас нельзя быть абсолютно уверенным в том, что полученный белковый образец является действительно индивидуальным белком. Нередки случаи, когда считавшийся гомогенным белок оказывался при анализе более совершенным методом неоднородным. Примером могут служить смеси изоферментов - чрезвычайно близких по свойствам и с одной и той же субстратной специфичностью белков. Долгое время о существовании этих изомеров просто не знали, поскольку они обычными классическими методами фракционирования не разделяются.

Не следует упускать из виду и тот факт, что многие белки в процессе анализа могут изменять свои свойства, в частности, денатурировать. В результате, можно прийти к ошибочному заключению о наличии в смеси двух и более различных белков. На самом деле, эта смесь может представлять собой один и тот же белок в нативной и денатурированной формах.

Одним из легкодоступных, несложных и достаточно надежных критериев гомогенности белка является проба на растворимость. Этот показатель для однородного белка не должен изменяться при повторениях одной или нескольких стадий очистки. Кроме того, величина растворимости индивидуального белка не должна зависеть от величины взятой навески. Практически это легко проверяется. Берется серия навесок белка с возрастающей массой в градуированные пробирки. Все пробирки заполняются до одного и того же объема растворителем. После полного растворения фильтруют все растворы и определяют концентрацию белка в каждом из них. Для индивидуального белка график зависимости количества растворившегося белка от величины взятой навески будет состоять из двух линий (см. рис., лини 1,2), одна из которых (линия 2) параллельна оси абсцисс (насыщение).

При наличии белковых примесей полученный в эксперименте график будет выглядеть иначе. На графике проявится промежуточная зона, между начальной прямой растворимости и прямой насыщения (см. рис.). Этот дополнительный участок (2') появляется потому, что предел растворимости по основному белковому компоненту смеси наступает значительно скорее чем по белку примеси. Увеличение растворимости белка (отрезок 2') будет происходить до тех пор, пока не будет достигнут предел растворимости и по белку примеси. Проба на растворимость является одним из наиболее строгих критериев гомогенности белка. Степень очистки белка принято контролировать как минимум двумя независимыми методами. Например, дополнительно к растворимости степень чистоту выделенного белка проверяют методом аналитического центрифугирования. Седименто-грамма чистого белка должна иметь единственный симметричный пик правильной формы (см.рис.).

Для проверки чистоты можно воспользоваться методами ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, ТСХ, бумажной хроматографии. Во всех случаях должно наблюдаться только одно вещество.