Структурная биохимия - Учебное пособие - Е. А. Бессолицына 2015

К белкам относят полипептиды, способные самопроизвольно формировать и удерживать определенную пространственную структуру. Нельзя указать такого порога, границы, которые резко отделяли бы белки от пептидов. Действительно, известная способность к образованию предпочтительных конформаций в растворах замечается уже у сравнительно коротких пептидов, более того, эта способность существенна для функции некоторых пептидов (например, гормонов), облегчая их взаимодействие с клеточными рецепторами. И всё же это только прообраз четкого соотношения между последовательностью аминокислот и пространственной структурой, которое составляет важнейшую отличительную особенность белка.

Стабилизация пространственной структуры требует хорошо развитой системы нековалентных взаимодействий, что может быть достигнута лишь, начиная с некоторой длины полипептидной цепи. Известны белки, полипептидная цепь которых содержит всего лишь около пятидесяти аминокислотных остатков. К ним относятся, например, панкреатический ингибитор трипсина, фактор роста эпителия, некоторые белки оболочек бактериофагов. Однако такие случаи относительно редки и белки чаще всего содержат 100 — 400 аминокислотных остатков, в одной полипептидной цепи, образующей глобулярную структуру.

Впрочем, длина полипептидной цепи может быть и гораздо большей, достигая тысячи остатков и более. Известны и так называемые полибелки. Они представляют собой еще более длинную полипептидную цепь, формирующую последовательно несколько вполне автономных как в структурном, так и в функциональном отношении глобул, которые после разрезания полибелка по местам «перетяжек» протеиназами существуют как независимые друг от друга ферменты. Видимо, сам по себе механизм биосинтеза не накладывает существенных ограничений на длину полипептидной цепи белка.

Следует подчеркнуть, что переход от пептида к пространственно структурированной, компактной белковой глобуле определяется не механическим удлинением полипептидной цепи, а специфической последовательностью аминокислотных остатков. Иными словами, вовсе не обязательно случайно построенная полипептидная цепь самопроизвольно образует компактную пространственную структуру. Весьма вероятно, что способность к самосборке свойственна ограниченному кругу последовательностей, среди которых и те, что соответствуют природным белкам и отобраны в ходе эволюции. Во всяком случае, известны последовательности аминокислот, не свертывающиеся в компактную структуру.

Столь большое значение, которое придают самосборке пространственной структуры как отличительному признаку белка, объясняется тем, что именно она служит основой всех свойств белка, прежде всего его биологической функции. Физические характеристики белка как полимера полностью определяются его способностью формировать компактную глобулу, от особенностей которой зависит и олигомеризация многих белков. Химические и функциональные свойства белков зависят от специфических взаимодействий функциональных групп, сближенных, в его пространственной структуре. Вследствие этого поведение этих трупп в белках коренным образом отличается от их реакционной способности в аминокислотах и небольших пептидах. Соответственно белок может функционировать, т. е. выступать в качестве фермента, структурного или транспортного белка, регулятора, токсина, ингибитора только потому, что он обладает вполне определенным пространственным строением.

В белке также, как и в пептиде аминокислоты соединены в полипептид пептидными связями, и имеется N-конец (начало) и С-конец (хвост).

Физико-химические химические свойства белков и пептидов сходны и зависят от аминокислот, входящих в их состав. Единственное отличие связано с изоэлектрическая точка определяется прежде всего группировками радикалов аминокислот, причем тех которые экспонированы на поверхность. N- и С-концевыми группировками можно пренебречь. Таким образом, свойства белка определяются радикалами аминокислот, экспонированными на поверхность.

По составу белки разделяют на:

Простые. Состоят только из полипептида.

Сложные. Содержат компонент непептидной природы, называемый простетической группой. В качестве простетической группы могут выступать липиды (в липопротеидах), углеводы (в гликопротеинах), фосфаты (в фосфопротеинах), гемы (в гемопротеинах), флавиновые нуклеотиды (в флавопротеинах), ионы металлов (в металлопротеинах) и др.

По форме молекулы белки разделяют на:

1. Глобулярные — представляют собой плотную компактную структуру по форме близкую к сфере. Обычно хорошо растворимы в воде, легко диффундируют.

2. Фибриллярные — вытянутые длинные молекулы, обычно нерастворимы (кератин, миозин, коллаген). К фибриллярным белкам относятся сократительные белки мышц актин и миозин, белки микротрубочек в составе ресничек и жгутиков эукариот и т. д.

Как можно видеть, данные виды классификаций не являются удовлетворительными, так как в одном классе слишком много разнообразных белков. Более точной и наиболее используемой является классификация по функции.

По функции белки разделяют на:

Ферменты. Практически все реакции в организме — ферментативные. К настоящему времени известно более 2000 ферментов.

Транспортные белки делятся на две группы: транспортеры через мембрану и «растворимые транспортеры». К транспортерам через мембрану относят пермеазы и порины, осуществляющие пассивный транспорт, и транспортные АТФ-азы, осуществляющие активный транспорт. Система транспорта через мембрану характерна как для одноклеточных, так и у многоклеточных организмов (в основе все равно клетка). У многоклеточных организмов кроме мембранных транспортных белков, осуществляющих обмен между клеткой и окружающей средой, есть и специализированные белки, которые осуществляют транспорт веществ по кровеносной системе. Функция гемоглобина — транспорт кислорода, сывороточного альбумина — транспорт жирных кислот, гидрофобных аминокислот, стероидных гормонов и т. д.

Пищевые и запасные. Использование белков в качестве резервных невыгодно с энергетической точки зрения. Однако это необходимо для обеспечения роста потомства: белки семян, яичный белок (овальбумин), казеин молока и т. д. Эти белки являются источником аминокислот и/или других молекул, или энергии для построения собственного организма. Именно поэтому в семенах и яйцах имеется достаточный запас однородного белка, дающего как запас аминокислот для роста и развития организма, так и энергию для этого организма, но в значительно меньшей степени.

Сократительные и двигательные. Актин и миозин обеспечивают сокращения мышц высших животных. Миозин также является АТФ-азой, то есть для обеспечения работы мышц расходуется энергия гидролиза АТФ. Тубулин — белок, из которого построены микротрубочки, деин, входящий с в состав микротрубочек, обеспечивает движение ресничек, жгутиков.

Структурные. Придают прочность ткани. Коллаген, эластин — основные белки соединительной ткани, обеспечивают прочность сухожилий, связок и т. д. Волосы, ногти, когти состоят почти исключительно из белка кератина. Шелк и паутина — из белка фиброина.

Защитные. Очень разнообразная группа белков. К ним можно отнести антитела, обеспечивающие узнавание чужеродных белков и полисахаридов и запуск защитных реакций. Фибриноген и тромбин обеспечивают свертывание крови, защищая организм от кровопотери при механических повреждениях. Змеиные яды, микробные токсины — защищают от других организмов. В эту же группу можно отнести ферменты, обеспечивающие трансформацию чужеродных веществ.

Регуляторные. Репрессоры (регулируют биосинтез). Сюда же можно отнести белки-рецепторы, вмонтированные в плазматическую мембрану и служащие для преобразования различных сигналов от других клеток и органов.

Прочие. Функции белков настолько разнообразны, что некоторые из них трудно отнести к какой-то группе. Например, плазма некоторых арктических рыб содержит белки со свойствами антифриза, что позволяет им переносить отрицательные температуры.

Еще на заре современной химии белка датский биохимик К. Линдерштрем-Ланг предложил рассматривать четыре уровня организации белковой молекулы: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Эта классификация закрепилась в литературе, поскольку в ней отразились реальные ступени формирования пространственного строения белковых молекул.

Первичной структурой называют последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Она кодируется структурным геном данного белка и содержит в себе все необходимое для самоорганизации его пространственной структуры. Последовательность аминокислот образуется в результате трансляции мРНК. Однако первичная структура зрелой белковой молекулы далеко не всегда полностью совпадает с непосредственным продуктом трансляции, который, как правило, подвергается более или менее существенной ко- и посттрансляционной модификации, процессингу, причем могут изменяться аминокислотные остатки, длина полипептидной цепи и т. п.

Аминокислоты в полипептиде соединены пептидной связью. Таким образом первичная структура белка образована пептидными связями. Традиционное изображение пептидной связи не вполне правильно передает ее электронную структуру. Двойная связь С=0 карбонильной группы поляризована и в определенном смысле может быть представлена как одинарная связь с разделением зарядов, причем отрицательный заряд локализуется на атоме кислорода. Изучение кристаллических структур соединений, содержащих амидную связь, показало, что расстояние С—0 в них примерно на 10% больше свойственного карбонильной группе в альдегидах и кетонах. Напротив, связь С — N за счет смещения свободной электронной пары азота к углероду приобретает в определенной мере характер двойной и укорочена опять-таки примерно на 10%. По Л. Полингу, электронная структура пептидной связи передается двумя резонансными структурами, причем на долю структуры II с двойной связью углерод — азот в гибриде приходится около 40%. В результате азот пептидной связи практически полностью утрачивает основность. Таким образом, пространственное строение полипептидной цепи может быть представлено как последовательность плоских элементов — пептидных группировок, соединяющихся между собой через С -α-атомы, которые служат своего рода шарнирами. Вращение плоских пептидных группировок может происходить вокруг двух простых связей, которые соединяют атом азота с С α -атомом (N — Со) и С- α -атом с углеродом карбонильной группы (С α — С (0)). Жестких запретов для вращения вокруг этих связей нет, однако есть некоторые предпочтительные конформации.

Рисунок 68. Первичная структура белка. Прямоугольниками отмечена пептидная связь

Последовательность аминокислот в полипептиде определяет их дальнейшее взаимодействие между собой, а, следовательно, более высокие уровни организации белка. То есть, структура и функции белковой молекулы определяются ее аминокислотной последовательностью. Следовательно, это очень важно — определять первичную структуру белка.

Определение аминокислотной последовательности белков (секвенирование белков) дает наиболее полную информацию о первичной последовательности белка, но этот сложный и дорогой метод появился достаточно поздно. До него существовал более простой способ определения состава белка, который позволял определить какие аминокислоты и в каком количестве входят в состав белка.

Рисунок 69. Определение аминокислотного состава белка

Это не совсем полный анализ, но он дает достаточное количество информации. Определение аминокислотного состава необходимо для характеристики исследуемого белка, а также пептидных фрагментов, получаемых в ходе анализа первичной структуры. Для расщепления до свободных аминокислот пептид или белок подвергают исчерпывающему гидролизу, нагревая его с постоянно кипящей (5,7 М) HCl при 105°С в течение 24 ч. Поскольку в таких условиях пептидные связи остатков изолейцина и валина гидролизуются не полностью, проводят также 48- и 72-часовой гидролиз.

Ввиду этого для получения более надежных величин содержание валина и изолейцина оценивают, экстраполируя найденные значения к «бесконечному» времени, а содержание серина и треонина определяют — экстраполяцией к «нулевому» времени гидролиза. Некоторые аминокислоты вообще не выдерживают кислотного гидролиза и разрушаются практически полностью, поэтому для их определения требуются специально разработанные приемы. Образовавшуюся смесь аминокислот анализируют с помощью тонкослойной хроматографии (Рисунок 69).

Этот метод основан на различной подвижности молекул на носителе. Смесь молекул наносят на слой носителя (на пример бумага или пластинка со слоем силикагеля) и и край погружают в растворитель (обычно смесь гидрофобных и гидрофильных растворителей). Под действием капиллярных сил растворитель начинает двигаться по носителю (вверх восходящая хроматография, вниз нисходящая), когда растворитель достигает нанесенного пятна смеси, молекулы растворяются и движутся вместе с носителем, чем меньше сродство молекулы р растворителю, тем быстрее она оседает на носитель, следовательно меньше расстояние от старта (l), и наоборот, чем больше сродство молекулы к растворителю, тем l больше, расстояние пройденное от старта растворителем обозначают как L. Подвижность молекулы при хроматографии — это индивидуальный параметр для каждой молекулы в каждой отдельной системе растворителя. Подвижность или Rf рассчитывают по формуле:

Rf=l/L

Существуют специальные таблицы Rf в различных системах растворителей, по которым можно идентифицировать молекулы в исследуемых смесях и гидролизатах. Но обязательно использовать таблицы подвижности в системах растворителей, которые применялись для хроматографии, иначе данные будут искажены.

Гидролизат белка разделяют методом тонкослойной хроматографии, затем хроматограмму проявляют (используя качественные реакции на аминокислоты, чаще всего с нингидрином), затем рассчитывают Rf или сравнивают с пробегом маркерных аминокислот. Так определяют какие аминокислоты входят в состав белка. Количество каждой аминокислоты в белке определяют, элюируя аминокислоту с носителя и определяя ее количество в пятне. Имея это значение, количество гидролизованного белка и нанесенного гидролизата, можно рассчитать количество аминокислоты в белке. В настоящее время используют автоматические анализаторы, впервые описанные У. Хтейном, С. Муром и Д. Спекмэном. Их конструкции весьма разнообразны, однако все они основаны на описанном выше методе.

Но, естественно, более информативны методы определения аминокислотной последовательности.

При определении аминокислотной последовательности к белку добавляют фенилизотиоцианат (реагент Эдмана); в результате реакции происходит отщепление N-концевого остатка в виде его фенилтиогидантоинового производного (реакция Эдмана). Идентификацию фенилтиогидантоиновых производных производят с помощью жидкостной хроматографии под давлением. Оставшийся белок снова обрабатывают реактивом Эдмана, и снова по циклу (Рисунок 70). Этот метод позволяет автоматизировать процесс определения. Приборы позволяют проводить полностью автоматизированное определение последовательности полипептидов, содержащих до 30—40 остатков (в некоторых случаях до 60 или даже до 80 остатков) за один прогон. Но белки имеют большую длину, поэтому их расщепляют на более короткие фрагменты в идеальном случае длиной 30—40 аминокислотных остатков, причем разрезание должно происходить не случайным образом а после определенных аминокислотных остатков. Этим требованиям отвечает расщепление

Рисунок 70. Схема определения аминокислотной последовательности по методу Эдмана

цианогенбромидом (CNBr), трипсином и о-иодозобензолом, также часто используют протеиназы, узнающие и разрезающие определенные последовательности аминокислот. Полученные фрагменты разделяют с помощью хроматографии и определяют последовательность.

Кроме того для определения первичной структуры белка все чаще прибегает к анализу последовательности нуклеотидов в соответствующем структурном гене или кДНК, что требует гораздо меньшего времени и дает в целом точные результаты. Однако такой путь не всегда практичен, так как при этом необходимо выделение и клонирование гена. Кроме того, он не позволяет обнаружить посттрансляционные модификации, без выявления которых исследование структуры белка нельзя считать завершенным.

Число установленных первичных структур быстро нарастает — еще в 1965 г. их счет шел на единицы, в 1975 г. было известно около 600, в1984 г. — 2500 последовательностей, содержащих около 0,5 млн. аминокислотных остатков, к концу 1980 г. Эти цифры возросли соответственно до 14400 и 4 млн.

Белки, выполняющие одинаковую функцию в организмах различных видов (например, гемоглобин) называются гомологичными. Обычно гомологичные белки — это полипептиды одинаковой или почти одинаковой длины. Во многих положениях всегда находятся одни и те же аминокислотные остатки, называемые инвариантными остатками. В других положениях аминокислоты варьируют от вида к виду, такие остатки называются вариабельными. Всю совокупность сходных черт в последовательностях гомологичных белков объединяют в понятие гомология последовательностей; наличие такой гомологии предполагает, что хозяева этих белков имеют общее эволюционное происхождение. Число остатков, по которым отличаются молекулы, пропорционально филогенетическому различию между видами. Например, цитохромы с лошади и дрожжей отличаются по 48 остаткам из 104, утки и курицы — по 4 остаткам, курицы и индейки — идентичны, свиньи, коровы и овцы — также идентичны. Исследование гомологии последовательностей используют для составления эволюционных карт.

Прежде, чем переходить к другим типам структуры белков, напомним, что мы имеем в виду под двумя важными терминами.

Конфигурация — пространственная организация органической молекулы, определяемая наличием в ней 1) двойных связей, вокруг которых невозможно свободное вращение, 2) асимметрических атомов углерода с расположенными вокруг них в определенной последовательности замещающими группами. Отличительным признаком конфигурационных изомеров является то, что их нельзя превратить один в другой без разрыва ковалентной связи. Конфигурационные изомеры можно разделить.

Конформация — термин, используемый для описания пространственного расположения в органической молекуле замещающих групп, способных изменять свое положение без разрывов связей благодаря свободному вращению вокруг свободных одинарных С-С-связей. Различные конформации нельзя отделить друг от друга.

Вторичной структурой называют пространственное расположение атомов главной цепи молекулы белка на отдельных ее участках. В соответствии с этим определением любой участок белка имеет вторичную структуру. Иногда рассматривают как вторичную структуру только те ее элементы, которые являются периодическими: α-спираль и β-слой. Понятие вторичной структуры, как подчеркивается в его определении, относится не ко всей белковой молекуле в целом, а к отдельным, более или менее протяженным участкам ее полипептидной цепи. Вторичная структура обеспечивается нековалентными водородными связями между частично отрицательным кислородом карбонильной группы пептидной связи и частично положительным водородом амидной группы другой пептидной связи.

Следует различать два вида вторичных структур: регулярные и нерегулярные. К регулярным относят α -спираль β-слой, β-изгиб, к нерегулярным — неупорядоченный участок.

В 50-х годах Л. Полинг и Р. Кори, основываясь на данных о структуре кристаллов аминокислот и простых пептидов, рассмотрели возможные периодические конформации полипептидной цепи и пришли к выводу, что наиболее вероятна структура, названная ими α -спиралью (Рисунок 71). При этом в основу выбора именно этой вторичной структуры были положены следующие критерии:

1. Образование плотноупакованной компактной структуры без пустот и перекрывания атомов.

2. Максимальная насыщенность структуры водородными связями с тем условием, чтобы геометрия водородной связи С-О — — — H-N была близка к линейной.

3. Соблюдение межатомных расстояний и углов, свойственных аминокислотам и простым пептидам.

С соблюдением этих условий можно построить как правую, так и левую α -спирали, однако правая α -спираль оказывается энергетически несколько выгоднее левой, если пептидная цепь образована L-аминокислотами. Между С=0- и N — Н-группами устанавливаются водородные связи так, что карбонильная группа i-ro остатка образует связь с N — Н-группой (i +4) -го, карбонильная группа (i +1) -го — с N — Н-группой (i +5) -го и т. д. То, что «над» карбонильной группой i-ro остатка оказывается NH-группа, а не карбонил (i +4) -го остатка, примерно и соответствует 3,6 остатка на оборот спирали, отрицательный заряд концентрируется на кислороде карбонильной группы, а положительный — на атоме азота. Возможности образования водородных связей между пептидными группами в α -спирали использованы сполна. В этом смысле α -спираль является как бы насыщенной, внутренне замкнутой.

Она не способна к взаимодействию с другими элементами вторичной структуры за счет образования водородных связей между пептидными группами. В формировании пространственной структуры белка важную роль играют нековалентные контакты, в которых участвуют боковые цепи аминокислот, входящих в α -спираль. При этом существенно, что на поверхности α -спирали оказываются сближенными боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками в пептидной цепи. Если в этих позициях находятся гидрофобные аминокислоты, они образуют своеобразный гидрофобный гребень.

Взаимодействие между такими гребнями используется как способ упаковки α -спиралей в пространственной структуре белка. Точно так же могут быть образованы и гидрофильные, в частности заряженные, поверхности. Поэтому α -спираль — может быть чисто гидрофобной, что характерно для трансмембранных участков белков, или амфифильной, т. е. обладающей как гидрофобной, так и гидрофильной сторонами.

Рисунок 71. Структура α-спирали. А — схема взаимодействия аминокислот в α-спирали; Б — структура α-спирали

Длина α-спиральных участков в глобулярных белках относительно невелика и обычно составляет 5—15 аминокислотных остатков, редко превышая 3—4 оборота спирали; в фибриллярных белках она гораздо протяженнее. Иногда наблюдаются изломы спирали, обычно в местах включения остатков пролина, прерывающих систему водородных связей. При этом ось спирали отклоняется на 20—30°.

Не любой полипептид будет образовывать α-спираль. Так, если в цепи встречается подряд несколько остатков глутамата или аспартата, при нейтральных рН полипептид не примет конформации α-спирали вследствие взаимного отталкивания отрицательных карбоксильных групп. Аналогично α-спираль не будет образовываться в случае большого числа близко расположенных остатков лизина, несущих положительный заряд. Близко расположенные аминокислоты с отрицательно заряженными радикалами также взаимно отталкиваются, нарушая α-спираль. Гистидин, триптофан, лейцин, аргинин мешают образованию α-спирали вследствие большого размера R-групп. В пролине атом азота входит в состав жесткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг N-С-связи. Кроме того, при атоме азота пептидной связи, образованной с участием амидной группы пролина, нет атома водорода. Следовательно, не может образоваться внутрицепочечная водородная связь. Как следствие, во всех случаях, когда в цепь включаются один или несколько остатков пролина, нарушается регулярная структура — образуются петля или изгиб.

В отличие от α -спирали β-структура стабилизируется взаимодействиями между соседними отрезками пептидной цепи, т. е. несколько более отдаленными аминокислотами, которые могут даже принадлежать к разным полипептидным цепям (Рисунок 72). Эти отрезки могут быть направлены в одну сторону (N-концы взаимодействуют с N-концами) — параллельная β -структура или в противоположные (N-конец взаимодействует с С-концом) — антипараллельная β -структура. NH-группа какого-либо остатка в отрезке А дает водородную связь с карбонильной группой i-го остатка пептидной цепи В, а карбонильная группа того же аминокислотного остатка цепи А — с NH-группой (i +2) -го остатка в параллельной цепи В. Важно, что (i +1) -й остаток цепи В при этом как бы пропущен и его NH- и карбонильная группа во взаимодействии с цепью А не участвуют. Точно так. же далеко не все С=О- и NH-группы цепи А участвуют во взаимодействии с цепью В.

Таким образом, два отрезка параллельной β -структуры соединяются водородными связями, что приводит к формированию больших циклов из 12 атомов. Еще раз нужно подчеркнуть, что в каждой из цепей во взаимодействии с соседней участвует только половина групп, которые могли бы образовать водородные связи. Следовательно, каждый из этих участков пептидной цепи может образовать такую же систему, следовательно образовывать взаимодействия со следующим фрагментом полипептидной цепи, а его свободные группировки пептидных связей, со следующим, за счет чего слой и расширяется.

Радикалы как в спирали не участвуют в образовании β-слоя, радикалы аминокислот направлены вверх относительно поверхности β-слоя, формируя как бы «ворс на ковре». Следует иметь в виду, что поверхность β -складчатого листа редко является плоской, чаще она закручена влево, если смотреть перпендикулярно ходу отрезков. Угол между соседними отрезками цепи составляет при этом около 25°. Многократное повторение такого мотива приводит к закручиванию листа в структуру, подобную винтовой лестнице. Описаны также «барабаны», получающиеся при сворачивании протяженного β-листа, когда крайние отрезки пептидной цепи смыкаются, формируя между собой систему водородных связей, которая свойственна β-структуре. Очевидно, что β-структура в таких случаях утрачивает характер локального образования, подчас пронизывая всю белковую глобулу (и перерастает рамки данного в начале главы определения вторичной структуры). Учитывая это, к протяженным β-складчатым листам, играющим важную роль в формировании третичной структуры белка, применяют термин супервторичная структура.

Рисунок 72. Структура β-слоя

Как α-спираль, так и β-структура обычно представлены в глобулярных белках сравнительно короткими отрезками, поэтому значительная часть вторичной структуры белка приходится на разного рода петли, позволяющие изменить направление пептидной цепи. Наиболее экономный структурный элемент, позволяющий повернуть полипептид на 180°, используя всего три пептидные группировки, получил название β-изгиба (Рисунок 73). β-Изгиб стабилизируется одной водородной связью. Его образованию могут мешать объемистые боковые цепи аминокислот, поэтому предпочтительно включение в него остатка глицина. Заметим, что β-изгиб практически всегда оказывается на поверхности белковой глобулы, поэтому нередко он играет существенную роль в ее взаимодействии с другими молекулами, например с иммуноглобулинами.

Рисунок 73. Структура β-изгиба

Неупорядоченные фрагменты чаще всего находятся на С-конце, также располагаются и внутри цепи. Эти участки не имеют своей точной оформленной структуры, а принимают ее уже в составе третичной структуры. С одной стороны это не достаточно стабильная структура, но очень часто такие петли участвуют в формировании функциональных центров белков, на пример, каталитических центров ферментов. И неупорядоченность отдельного фрагмента компенсируется полной упорядоченностью в составе уже третичной структуры белка.

Появление термина супервторичная структура связан с тем фактом, что при накоплении данных о структуре белков выяснилось, что некоторые элементы вторичной структуры уже не совсем соответствуют этому названию. Так β-слой достаточной ширины может изгибаться, образуя бочонко- или лопастиподобные структуры. Такие структуры «пронизывают» всю белковую глобулу, но все-таки образуются частью полипептидной цепи, формируя что-то вроде центральной («градообразующей») структуры белковой глобулы. Следовательно, подобные конструкции относятся к вторичным структурам, но их размеры позволяют прибавить приставку супер.

Рисунок 74. Супервторичная структура белка. коллагена. А — организация фибриллы; Б — структура связи между остатками лизина

Второй такой пример появился при изучении структуры коллагена. У высших животных значительную часть организма составляет соединительная ткань. Три ее главных компонента коллаген, эластин и протеогликаны. Коллаген и эластин — примеры фибриллярных белков. Они формируют два основных типа волокон соединительной ткани: коллагеновые и эластические.

Коллаген — уникальная спираль, не встречается больше ни в каких белках (α- и β-спирали — хотя бы на отдельных участках глобулярных белков). Фибриллы состоят из повторяющихся полипептидных частиц тропоколлагена, уложенных вдоль фибриллы в виде параллельных пучков по типу «голова к хвосту». Состоят из 3 полипептидных цепей, плотно скрученных в виде трехжильного каната. Образуется палочкообразная молекула длиной 300 нм и толщиной 1,5 нм, массой около 300 000 Д. Три цепи имеют равную длину, в каждой содержится около 1000 аминокислотных остатков. В одних коллагенах все 3 цепи одинаковы, в других одинаковы 2, третья отличается. Каждая цепь также представляет собой спираль, отличную от α и β-структур. За счет высокого содержания пролина и оксипролина образуется жесткая изогнутая конформация. Дополнительно цепи связаны поперечными водородными и необычными ковалентными связями между остатками лизина (Рисунок 74).

Коллаген практически нерастяжим из-за очень плотной скрученности и множества поперечных связей. С возрастом число поперечных связей растет. В очень эластичном белке соединительной ткани эластине содержится очень много лизина и мало пролина. Образуется спираль особого типа. Для нее характерно чередование спиралей из богатых глицином участков с более короткими участками лизина и аланина. 4 молекулы лизина ферментативно образуют одну молекулу десмозина.

Третичной структурой называют распределение в пространстве всех атомов белковой молекулы. При этом не учитывают взаимодействия этой глобулы с соседними глобулами или субъединицами. Часто понятие третичной структуры сужают, концентрируя внимание на наиболее устойчивом ее элементе — свойственном данному белку способе укладки полипептидной цепи в пространстве. Характерно, что для больших групп эволюционно родственных белков, подчас очень значительно отличающихся по первичной структуре и, значит, по распределению всех атомов в пространстве, способ укладки полипептидной цепи остается в главных чертах неизменным. Это показывает, что допускаемое упрощение оправдано, так как оно отражает существенные черты третичной структуры.

Третичная структура — основа функциональности белка, которая требует точной пространственной организации больших ансамблей, построенных из множества аминокислотных остатков и их боковых групп. Такие ансамбли формируют активные центры ферментов, зоны связывания других биологических молекул, эффекторные центры белков и т. д., поэтому нарушение третичной структуры белка (денатурация) неизменно приводит к утрате им способности функционировать.

В образовании третичной структуры участвует множество видов связей ковалентных и нековалентных, между радикалами аминокислотных остатков и элементами пептидных связей.

К ковалентным относятся дисульфидные связи, которые за счет большей прочности сильно стабилизируют белок. Дисулъфидные связи образуются при окислении сближенных в пространственной структуре белка остатков цистеина в остатки цистина. Как уже упоминалось, это единственный тип ковалентных связей, участвующих в дополнение к обсужденным выше нековалентным взаимодействиям в стабилизации третичной структуры. Таким образом, наличие в белке дисульфидных связей вовсе не является непременным условием его стабильности. Однако немало белков, в том числе достаточно стабильных, вовсе их лишены. Например, РНК-аза один из самых стабильных белков, сохраняющий функциональность даже после десяти минут кипячения. По-видимому, стабилизация белковой структуры дисульфидными связями объясняется, прежде всего, тем, что они, сохраняясь денатурированном белке, резко сокращают число возможных конфигураций развернутой полипептидной цепи, понижая тем самым ее энтропию.

Типов нековалентных взаимодействий при формировании третичной структуры больше и, следовательно, именно они обеспечивают основную укладку и стабилизацию белковой молекулы.

Это прежде всего водородные связи, которые представляют собой электрические взаимодействия между частично положительно заряженным атомом одной группировки и частично отрицательным другой. Эти связи могут образовываться между карбонилом одного аминокислотного остатка и амидом другого, данные группировки являются элементами пептидной связи, участвуют в формировании вторичной структуры.

При формировании третичной структуры также образуются водородные связи между элементами пептидной, но уже в неупорядоченных петлях, также добавляются водородные связи между частично заряженными группировками радикалов неионных гидрофильных аминокислот, увеличивая количество водородных связей. Второй вид связей сходных по своей природе с водородными — ионные. Это электрические взаимодействия между ионизованными группировками радикалов кислотных и основных аминокислотных остатков.

Последняя группа нековалентных связей — гидрофобные или ван-дер-ваальсовы, которые представляют собой перекрывания гидрофобных радикалов аминокислот, которые как и в мембранах, как бы изолируются от воды под гидрофильными фрагментами полипептида, взаимодействуя только друг с другом.

Учитывая тот факт, что третичная структура — основа функциональности белка и огромное многообразие белков, можно сказать, что структура каждого отдельного белка уникальна.

Для определения третичной структуры белка используется метод рентгеноструктурного анализа полимерных молекул, принцип которого заключается в следующем. Пучок рентгеновских лучей направляют на кристалл белка, где они сталкиваются с атомами и происходит отклонение лучей от основной оси на определенный угол, проходя сквозь кристалл отклонившиеся лучи засвечивают пленку, в зависимости от атома, с которым произошло столкновение угол отражения отклонившиеся лучи будут суммироваться или взаимовычитаться, это явление называется дифракция. С учетом дифракции по пятнам на рентгенограмме и известны углах отклонения определяют положение атомов в кристалле и их типы (именно поэтому белок должен быть в виде кристалла, чтобы все атомы были фиксированы). И уже по полученным данным, определяют положение атомов в молекуле, то есть третичную структуру. Этот процесс очень сложный, но в настоящее время определена структура множества белков, как было сказано ранее каждая из них уникальна, и изучить структуру всех известных белков не возможно, и даже специалисты изучают строго определенные группы белков, но, несмотря на это, можно выявить общие тенденции в образовании структуры белка.

Гидрофобное ядро

Молекулы большинства белков находятся в воде и гидрофильные аминокислоты могут образовывать связи с водой, если бы все аминокислоты в белке были гидрофильны, то преобладали бы взаимодействия с водой, а не с другими аминокислотами, и образование стабильной глобулы было бы невозможно (Рисунок 75). Поэтому часть аминокислот гидрофобные, они изолируются от воды под гидрофильными аминокислотами, создавая плотное компактное гидрофобное ядро, этому способствуют короткие ван-дер-ваальсовы связи, в результате молекула сворачивается в структуру по форме близкую к шару, так как у этой фигуры оптимальной соотношение поверхность/объем, и как следствие она более энергетически выгодна. В гидрофобное ядро, которое, вовсе не обязательно приближается к сферической конфигурации, но более или менее компактно, обычно входит 20—30% общего числа аминокислотных остатков. В нем особенно представлены объемистые остатки лейцина, изолейцина, фенилаланина, валина. Гидрофобное ядро окружено наружной гидрофильной оболочкой, имеющей контакт с водой. В ней содержатся гидрофильные аминокислотные остатки взаимодействующие как друг с другом так и молекулами воды, образующими гидратную оболочку белка из связанной с ним воды. Но наряду с ними немало и боковых цепей гидрофобных аминокислот — до половины их общего содержания. Нередко образуются своего рода гидрофобные пятна, «лоскуты», которые придают поверхности белка мозаичный характер, чередуясь со строго гидрофильными участками. Такие гидрофобные выходы могут иметь функциональное значение — они формируют гидрофобные участки зон связывания субстратов и других лигандов, участвуют в белок-белковых взаимодействиях, в частности в стабилизации четвертичной структуры. Также крупные гидрофобные участки поверхности белка характерны для интегральных мембранных белков.

Рисунок 75. Эволюционное развитие ядра и оболочек белка. Темно-серым отмечено гидрофобное ядро; светло-серым — гидрофильная поверхность; черным — гидратная оболочка

Домены в белках

Свойственный белкам способ организации пространственной структуры — формирование гидрофобного ядра и мозаичной поверхности, содержащей как гидрофильные, так и гидрофобные элементы, — на первый взгляд, ограничивает размеры глобулы, поскольку с увеличением ее объема строго гидрофобное ядро будет составлять все меньшую долю. В какой-то мере это так, но ограничение затрагивает лишь размеры данным способом организованной структуры, а не молекулы в целом. Действительно, начиная примерно с молекулярной массы 14 — 16 кДа прослеживается тенденция к формированию белковой молекулы из двух (и более) в той или иной степени независимо образованных глобул, каждая из которых имеет свое гидрофобное ядро. Такие глобулы — домены — формируются различными отрезками одной и той же полипептидной цепи (Рисунок 76).

Доменами в белках называют области в третичной структуре, которым свойственна определенная автономия структурной организации. Автономия эта подчас столь значительна, что домены могут независимо от других частей белковой молекулы поддерживать и даже формировать пространственную структуру. Во многих случаях удается разделить домены, подвергнув белок ограниченному протеолизу. В рамках биологической функции данного белка домены нередко, хотя и не всегда, выполняют собственные задачи, и тогда структурная автономия домена дополняется функциональной.

Например, нуклеотидсвязывающий домен дегидрогеназ, имеющий, независимо от конкретной функции того или иного фермента одинаковый способ укладки полипептидной цепи, ответствен за взаимодействие с одним из субстратов реакции — коферментом NAD или NADH. Аминоконцевые домены ферментов системы свертывания крови обеспечивают связывание с липидами мембраны и другими белками, аминоконцевые домены иммуноглобулинов формируют центр связывания антигена. Домен цинковый палец, представляющий собой β-слой из двух цепей с β-изгибом, дополнительно стабилизированы ионом цинка. Цинковый палец является ДНК-связывающим доменом у эукариот.

Уникальная последовательность аминокислотных остатков образует уникальный набор связей с экспонированными в большой желобок группами азотистых оснований, в зависимости от последовательности нуклеотидов ДНК набор экспонированных групп будет варьировать, а, следовательно, набор аминокислотных остатков в «пальце» будет отличаться, все это обеспечивает связывание со строго определенными последовательностями нуклеотидов в ДНК. У прокариот такую функцию выполняет домен «спираль-поворот-спираль», одна из α-спиралей взаимодействует с ДНК, по тому же принципу что и в «цинковом пальце», короткая петля или поворот, обеспечивает поворот на 90⁰ другой спирали, богатой основными аминокислотами, которые взаимодействуют с сахаро-фосфатным остовом ДНК.

Чаще всего домены формируются автономным свертыванием последовательно расположенных участков полипептидной цепи, хотя известны случаи, когда пространственная структура домена образована двумя далеко отстоящими друг от друга отрезками первичной структуры белка.

Рисунок 76. Примеры структуры некоторых доменов. А — домен пируваткиназы (тип β-бочонка), Б — «цинковый палец»; В — «лейциновая молния»

Естественно в образовании третичной структуры участвуют взаимодействуя и элементы вторичной. По соотношению и взаимодействию этих элементов выделены следующие главные типы пространственной структуры:

1. α-Спиральные белки, построенные преимущественно из α-спиралей. Простейший структурный мотив в таких белках — пучок четырех α-спиралей, оси которых более или менее параллельны. Именно такую структуру имеют миогемэритрин, Н-субъединица ферритина. Типично α-спиральными белками являются глобины.

2. β-Белки, образованные преимущественно β-складчатыми слоями. В большинстве таких белков β-слои наложены под небольшим углом или ортогональны. Примерами таких белков могут служить пепсин и другие аспартильные протеиназы, супероксиддисмутаза, большое семейство белков — переносчиков метаболитов (например, жирных кислот).

3. α/β-Белки, в которых α-спирали и отрезки β-структуры чередуются. Обычно это приводит к формированию центрального β-складчатого листа, окруженного с обеих сторон α-спиралями, экранирующими его от воды. Этот тип пространственной структуры очень распространен. К нему принадлежат NAD-связывающие домены дегидрогеназ, триозофосфатизомераза и около десятка других белков, структурно близких к этому ферменту.

4. (α + β) -Белки, в которых α-спирали и отрезки β-структуры не чередуются, а скорее группируются с себе подобными так, что часть молекулы приобретает пространственную укладку чисто α-спирального типа (тип 1, см. выше), другая — чисто β -типа (тип 2), нередко с элементами- (α / β) -структуры. К этому типу относится лизоцим куриного яйца.

Существуют также уникальные структуры.

Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка, т. е. нарушение, разупорядочение системы нековалентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентной структуры. Денатурация, как правило, сопровождается утратой белком функциональных свойств, его инактивацией. Однако инактивация сама по себе не может служить надежным критерием денатурации. К денатурации не следует относить конформационные переходы в белке, при которых одна кооперативная система нековалентных взаимодействий перестраивается в другую.

Принципиальная разница состоит в том, что в этом случае оба состояния упорядочены, тогда как характерным признаком денатурации является именно утрата упорядоченности, которая приводит к возрастанию энтропии системы. Однако встречаются, по-видимому, и случаи, когда белок претерпевает частичную денатурацию, например, вследствие утраты пространственной организации одним из образующих его доменов или нарушения системы нековалентных взаимодействий в каком-либо участке супервторичной структуры. Качественное рассмотрение показывает, что денатурация белка может быть вызвана действием ряда факторов.

По агентам воздействия выделяют два типа денатурации: физическая и химическая. Физическим денатурирующим агентом является температура. Так, повышение температуры приводит к возрастанию вклада энтропийного фактора, что обусловливает тепловую денатурацию, происходящую, как правило, скачкообразно. Температура денатурации белков различается и существенно зависит от других условий, например, многие белки заметно стабилизируются ионами кальция. Некоторые белки отличаются термостабильностью. Это особенно свойственно белкам термофильных организмов, адаптировавшихся к жизни при повышенных температурах. Например, протеолитический фермент, секретируемый термофильными бациллами, — термолизин — сохраняет активность до 80°С. Денатурация под действием температуры необратима, то есть при восстановлении оптимальной температуры белок не восстанавливает свою структуру.

Химическая денатурация происходит под воздействием на белок реагентов, нарушающих нековалентные взаимодействия, прежде всего систему водородных связей. Так как в составе третичной структуры белка существует несколько типов связей, и как следствие несколько механизмов.

Первый механизм — это конкуренция за водородные связи. Денатурирующий агент содержит частично положительные и отрицательные заряды, которые образуют водородные связи с группировками белка. И группировки в место связей между собой образуют связи с агентом и глобула распадается. Так действуют мочевина в больших концентрациях (6—8 М) гуанидин хлорид, гуанидин изотиоцианат.

Второй механизм — это изменение заряда групп. Это происходит при изменениях рН, при изменении рН среды группировки или протонируются, или депротонируются в результате взаимодействия между заряженными группировка разрушаются за счет изменения заряда, и как следствие молекула белка денатурирует. По этому механизму происходит денатурация с использованием кислот и щелочей.

Третий механизм — разрушение гидрофобного ядра. Так происходит денатурация с использованием органических растворителей. Органические растворители гидрофобные, и когда белок в них попадает уже поверхностные гидрофильные аминокислоты можно сказать «самоизолируются», тогда как гидрофобные аминокислоты ядра начинают взаимодействовать с растворителем, а не друг с другом, молекулу как будто выворачивает на изнанку. Но если правильно подобрать органический растворитель, то можно сохранить гидратную оболочку и тогда связи и среда белка не будут нарушены, и денатурация не произойдет, это позволяет использовать органические растворители для выделения и разделения белков.

Четвертый механизм совмещает в себе первый и третий. Заряженная группировка конкурирует за водородные связи, гидрофобная часть молекулы разрушает гидрофобные связи ядра. К таким агентам относя ионные детергенты, самый известный из них додецилсульфат натрия или (SDS), по такому же механизму осуществляют денатурацию мыла.

Денатурацию белка в определенных условиях in vitro удается обратить, перейдя от развернутой полипептидной цепи к компактной глобуле, имеющей вполне определенную пространственную структуру. Этот процесс, называемый ренатурацией, моделирует, хотя и не в полной мере, свертывание полипептидной цепи в глобулу в ходе трансляции при биосинтезе белка. Как известно, пространственная структура белка определяется его первичной структурой. Известное соотношение один ген — один белок, в сущности, эквивалентно утверждению, что генетически детерминированной последовательности аминокислот достаточно, для того чтобы однозначно предопределить ее свертывание в свойственную тому или иному белку третичную структуру. Разумеется, в общем случае такое заключение справедливо лишь для условий, близких к существующим в данной клетке при биосинтезе данного белка, которые могут включать в себя определенный диапазон рН, присутствие некоторых ионов, например ионов кальция, а также кофакторов, присущих этому белку, например коферментов, гема и т. п.

При соблюдении указанных условий будет достигнуто рассмотренное выше соотношение факторов, от которого зависит стабильность белковой глобулы, т. е. создадутся термодинамические предпосылки формирования нативной структуры — ренатурации белка. Это положение было подтверждено успешными опытами по ренатурации белков in vitro, проведенными впервые К. Анфинсеном и сотрудниками в 60-х годах, на панкреатической рибонуклеазе и лизоциме, а затем и на ряде других объектов. Однако не для всех белков химическая денатурация обратима, многие белки ренатурировать не удается, скорей всего это связано с тем, что нет возможности создать полностью необходимые для сворачивания условия, или в природе есть факторы не учитываемые исследователем.

Установлено, что при формировании пространственной структуры белка in vivo полипептидная цепь не предоставлена сама себе, а взаимодействует с целым рядом специализированных белков, получивших название шаперонов, функция которых — обеспечить быстрое нахождение правильной пространственной структуры. Известен ряд семейств шаперонов, которых особенно много среди так называемых белков теплового шока. Последние названы так, потому что они синтезируются клетками в больших количествах в ответ на воздействия, неблагоприятные для эффективного свертывания третичной структуры белков, в частности на повышение температуры. Однако они образуются и действуют и в нормальных условиях. Одно из семейств шаперонов составляют так называемые стресс-белки 70 эукариотических клеток, имеющие молекулярную массу около 70 кДа. Они образуют комплексы с еще не завершившими свертывание полипептидными цепями, предотвращая их взаимодействие между собой и нежелательную агрегацию. Эти белки состоят из двух взаимодействующих между собой доменов. Один из доменов образует комплекс с участками развернутой полипептидной цепи, другой — связывает АТР и способен расщеплять его, являясь медленно действующей АТР-азой. При гидролизе АТР белок переходит в другое конформационное состояние и его комплекс с полипептидной цепью распадается. То есть шаперон не сворачивает правильно, а разворачивает неправильное, критерием является количество энергии, поступившей в систему при гидролизе АТФ, хватило для разворачивания значит свернуто не правильно, не хватило — правильно.

Полипептидные цепи белков, которые подлежат транспорту из цитоплазмы, за счет образования комплексов со стресс-белками 70 удерживаются в развернутом, наиболее приспособленном для переноса через мембрану состоянии. Продолжительность жизни таких комплексов задается, по-видимому, временем, требующимся для внутримолекулярного гидролиза АТР, связанного стресс-белками 70. Пока не ясно, катализируют ли эти белки непосредственно само образование вторичной или третичной структуры. Не исключено, что их роль ограничивается предотвращением нежелательных для этого процесса межмолекулярных взаимодействий, агрегации еще не свернутых полипептидных цепей. Еще одну группу широко распространенных белков, вовлеченных в формирование третичной структуры, составляют так называемые шаперонины — белки, кодируемые генами GroEL и GroES у E. coli. Белки GroEL образованы субъединицами с молекулярной массой около 60 кДа, которые формируют своеобразную четвертичную структуру, построенную из двух лежащих одно на другом колец по семь субъединиц в каждом. Предполагают, что частично свернутая полипептидная цепь располагается на поверхности такого кольца. Отдельные ее участки, связанные субъединицами шаперонина с различной прочностью, могут высвобождаться из комплекса и формировать свойственную им вторичную структуру, не встречая помех со стороны соседних участков или других полипептидных цепей, удерживаемых в связанном состоянии. В таких условиях формирование регулярных элементов вторичной структуры происходит как бы поочередно. По завершении этого процесса комплекс распадается, что зависит, как и в рассмотренном выше случае, от расщепления АТР, связанного GroEL-белком. Белки GroES с молекулярной массой 10 кДа ассоциируют с белком GroEL и каким-то образом регулируют его АТР-азную активность и, значит, время жизни комплекса.

Четвертичной структурой называют размещение в пространстве взаимодействующих между собой субъединиц, образованных отдельными полипептидными цепями белка.

В формировании четвертичной структуры участвуют не пептидные цепи сами по себе, а глобулы, образованные каждой из этих цепей в отдельности. Таким образом, понятие четвертичной структуры относится к ансамблю глобул. Взаимодействие между последними достаточно сильно, так что ансамбль выступает как единая молекула, в то же время каждая из объединившихся глобул — субъединиц — сохраняет значительную автономию, как правило, выраженную гораздо ярче, чем автономия домена в рамках третичной структуры. Известны, однако, случаи, когда два или несколько полипептидов составляют единую глобулу. Как правило, это является следствием ограниченного протеолиза — локального расщепления на отдельные отрезки первоначально целостной полипептидной цепи, образовавшей глобулу по обычным правилам формирования третичной структуры. Такие белки, естественно, не следует относить к числу имеющих четвертичную структуру (Рисунок 77).

Примером может служить инсулин. Его мономер построен из двух пептидных цепей А и В, содержащих соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков.

В некоторых белках полипептидная цепь образует при свертывании несколько глобул (доменов), между которыми устанавливается система нековалентных взаимодействий. Последующее протеолитическое разрезание участков цепи, соединяющих домены между собой, делает их вполне автономными, переводит в ранг субъединиц, формирующих четвертичную структуру. Иногда в литературе используют термин «агрегат» как синоним понятия «четвертичная структура», с чем трудно согласиться, поскольку последнее подразумевает весьма высокий уровень организации — объединение субъединиц в. молекулу, стабилизированную системой нековалентных взаимодействий. Точно так же нет оснований классифицировать, как четвертичную структуру надмолекулярные (например, мультиферментные) комплексы или протяженные структуры, такие, например, как оболочки фагов или белковые кристаллические тела включения в некоторых бациллах, хотя в механизме их образования немало общего с формированием четвертичной структуры.

Четвертичная структура — последний уровень в организации белковой молекулы, к тому же не обязательный — до половины известных белков ее не имеют. Граница между белками, имеющими четвертичную структуру и лишенными ее, не всегда вполне определенна. Некоторые белки сравнительно легко диссоциируют на субъединицы уже, в которой одна из субъединиц (С — каталическая) ответственна за собственно ферментную активность и катализирует перенос фосфата АТФ на белок, а другая является регуляторной (Е). В отсутствие циклического AMФ последняя связана с С-субъединицей в комплекс R — С и ингибирует ее. При образовании комплекса с цАМФ четвертичная структура распадается и С-субъединица оказывается способной фосфорилировать белковые субстраты. Ярким примером гетеромерного белка может служить РНК-полимераза. В гомомерных белках субъединицы одинаковы. С ними сходны и такие, строго говоря, гетеромерные белки, субъединицы которых не одинаковы, но достаточно сходны как по способу свертывания полипептидной цепи, так и функционально. Частоты, с которыми встречаются белки, построенные из двух, трех, четырех и т. д. субъединиц, весьма различны. Так, для более или менее случайной выборки из примерно 200 белков с молекулярной массой не более 300 кДа оказалось димеров 102, тетрамеров 58, гексамеров 23, тогда как тримеров только 9, пентамеров ни одного, октамеров 3. Таким образом, подавляющая часть белков, имеющих четвертичную структуру, приходится на димеры, тетрамеры и гексамеры, причем последние встречаются у белков с молекулярной массой, большей 100 кДа. Геометрия симметричных димеров очевидна. То же относится и к тримерам, которые весьма редки, однако встречаются в природе. В частности, они могут играть существенную роль при образовании трансмембранных каналов, поскольку своего рода пучок из трех субъединиц сам по себе образует внутренний канал. В тетрамерных белках субъединицы могут размещаться в вершинах квадрата, что встречается редко, или же занимать вершины тетраэдра. Последний тип четвертичной структуры, в котором каждая субъединица взаимодействует с тремя остальными с различной силой, а молекула в целом оказывается весьма компактной, наблюдается особенно часто.

Для гексамерных белков характерна октаэдрическая упаковка, гораздо реже встречаются плоские гексагональные структуры. Субъединицы, образующие симметричную четвертичную структуру, бывают идентичными, но могут и отличаться, будучи в то же время однотипными, эволюционно родственными белками, которые обладают одинаковым способом свертывания пептидной цепи в пространстве. В этих случаях формирование четвертичной структуры имеет характерные особенности. Если, например, тетрамерный белок образован структурно гомологичными однотипными субъединицами а и в то в зависимости от степени их отличия возможны две ситуации. Другие же наборы субъединиц нестабильны и практически не обнаруживаются. Типичным примером является лактатдегидрогеназа человека, построенная из четырех субъединиц. Последние могут быть двух типов: М- (от англ. muscle — мышечная) субъединица, преобладающая в гладких мышцах, и Н- (от англ. heart — сердечная) субъединица, преимущественно синтезируемая в сердечной мышце. Для лактатдегидрогеназы возможен следующий набор множественных форм: Н4, М3Н1, M2H2, M1H3, H4. Заметим, что множественные формы, различия между которыми обусловлены генетически, а не вызваны посттрансляционными модификациями или повреждением белка, принято называть изоформами.

Разница в первичной структуре субъединиц отражается на соотношении катионных и анионных групп, что приводит к различиям в заряде изоформ и позволяет легко разделить их методом электрофореза. Такой анализ изоферментного состава лактатдегидрогеназы крови позволяет следить за поступлением в кровь лактатдегидрогеназы некоторых органов, в частности сердца при развитии соответствующей патологии, Например при некрозе сердечной мышцы. В последнем случае возрастет содержание изоформ, обогащенных Н-субъединицей. Этот подход нашел применение в медицинской диагностике и биохимической генетике.

Учитывая, что четвертичная структура не является обязательной для функционирования белка, очень много белков функционируют без наличия четвертичной структуры, но у четвертичной структуры есть определенные преимущества:

Увеличение активностей с одной компактной структуре, то есть это можно назвать возникновение четвертичной структуры необходимым механизмом эволюции доменов, когда домены окончательно становятся автономными и превращаются в отдельные субъединицы. Данные комплексы позволяют быстро осуществлять различные последовательности реакций метаболитических процессов.

Возможность регуляции.

Взаимодействие с изменением активности. (кооперативность изменения конформации протомеров)

Для отдельных субъединиц олигомерных белков и белковой глобулы в целом также характерны кооперативные изменения конформации. Рассмотрим это на примере гемопротеинов гемоглобина и миоглобина. Миоглобин — мономерный белок, гемоглобин — состоит из 4 протомеров двух типов. Первичная структура протомеров гемоглобина типов α и β отличается примерно на половину остатков (из 141 и 147 соответственно). Еще сильнее отличается первичная структура миоглобина. В то же время вторичная и третичная структуры протомеров гемоглобина и миоглобина очень сходны, они выполняют сходные функции, в основе которых лежит способность обратимо связывать кислород. Простетическая группа этих белков — гем — представляет собой плоскую молекулу, содержащую 4 пирольных кольца и соединенный с ними атом железа.

Гем соединяется с белковой частью (глобином) гидрофобными связями между пиррольными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. Кроме того, имеется координационная связь между атомом железа и имидазольным кольцом одного из остатков гистидина в глобине. За счет еще одной координационной связи к атому железа может присоединяться молекула кислорода с образованием оксигемоглобина или оксимиоглобина. Валентность железа при этом не изменяется.

Рисунок 77. А — структура гема; Б — третичная структура миоглобина; В — четвертичная структура гемоглобина

Пиррольные кольца гема находятся в одной плоскости, в то время как атом железа выступает из этой плоскости. Присоединение кислорода «выпрямляет» молекулу гема: железо перемещается в плоскость пиррольных колец. Поскольку железо связано с остатком гистидина глобина, происходит перемещение участка цепи, то есть изменение конформации белка. Для миоглобина изменение конформации ограничивается единственной полипептидной цепью. В гемоглобине же имеется четыре протомера, каждый из которых содержит гем и может присоединять кислород:

Hb ↔ HbO₂ ↔ Hb (O₂) 2 ↔ Hb (O₂) 3 ↔ Hb (O₂) 4

Первая молекула кислорода изменяет конформацию протомера, к которому она присоединилась. Поскольку этот протомер соединен с тремя остальными, изменяется конформация и других протомеров (Рисунок 78). Это явление называют кооперативностью изменения конформации протомеров. Следствием изменения конформации после присоединения первой молекулы кислорода является увеличение сродства трех остальных протомеров к кислороду. Присоединение второй молекулы еще сильнее облегчает присоединение кислорода к оставшимся двум свободным гемам. Сродство гемоглобина к четвертой молекуле кислорода примерно в 300 раз больше, чем к первой. Вследствие этого график зависимости насыщения гемоглобина кислородом от парциального давления кислорода представляет собой не гиперболу, как в случае насыщения миоглобина, а S-образную кривую.

Гемоглобин присоединяет кислород из альвеолярного воздуха, где парциальное давление близко к 100 мм рт. ст., здесь насыщенность гемоглобина близка к 100%. Отдается кислород при парциальном давлении около 40 мм рт. ст., здесь насыщенность гемоглобина кислородом близка к 75%. Далее цикл повторяется. Из представленных кривых видно, что миоглобин не смог бы справиться с задачей: при обоих парциальных давлениях насыщенность белка к кислороду близка к 100%. Функция миоглобина — промежуточное звено транспорта кислорода к митохондриям (основным потребителям кислорода) и создание в мышцах некоторого запаса кислорода (главным образом имеет значение для ныряющих животных). Кооперативные изменения конформации протомеров — важнейший механизм регуляции, в частности для аллостерических ферментов. Кстати, на этом же примере можно отметить еще две особенности. Гем в составе гемоглобина и миоглобина обладает способностью высокоспецифично присоединять молекулу кислорода. Эта специфичность обусловлена отличным от структурной комплементарности механизмом, зависящим в основном от реакционной способности атома железа. Однако и в этом случае специфичность определяется влиянием полипептида. Гем в составе других гемопротеинов — цитохромов — не способен присоединять кислород и служит переносчиком электронов. В процессе принятия и передачи электрона валентность железа гема цитохромов меняется. Вторая особенность. Протомеры дезоксигемоглобина могут избирательно связываться с 2,3-дифосфоглицератом, содержащимся в эритроцитах, причем участок связывания дифосфоглицерата отличен от участка связывания кислорода. Дифосфоглицерат несет 5 отрицательных зарядов, распределенных между 5 атомами кислорода. Его молекула оказывается во впадине, образованной двумя β-субъединицами, где она взаимодействует сразу с 7 катионными группами этих цепей (α-аминогруппы Val-1, имидазольные кольца His-2 и His-143 обеих цепей и аминогруппа Lis-82 одной из цепей). Вследствие связывания происходит стабилизация дезоксиформы и снижение сродства к кислороду. В отсутствие дифосфоглицерата HbA насыщается кислородом на 50% при его парциальном давлении 12 мм рт. ст., в присутствии — при 50 мм рт. ст. Это типичный пример так называемого аллостерического («другое место») механизма регуляции активности белков. Возможность воздействия эффектора на структурно удаленный функциональный центр белка основана на способности четвертичной структуры отвечать на относительно слабые воздействия. Природа приспособилась подстраивать рассмотренный механизм к конкретным условиям существования организмов. У высокогорных лам, живущих в условиях дефицита кислорода His-2 заменен на аспарагин, не несущий положительного заряда. В фетальном гемоглобине His-143 заменен на серин. В обоих случаях результатом является меньшее сродство к дифосфоглицерату и, как следствие, большее сродство гемоглобина к кислороду. В первом случае это позволяет достигать нужного насыщения крови кислородом в условиях разряженного воздуха, во втором — «отбирать» плоду кислород из крови матери. С олигомерными белками сходны белки доменного строения. Они также содержат в значительной мере обособленные глобулы — домены, однако эти глобулы образованы одной и той же полипептидной цепью.

Рисунок 78. Кооперативное взаимодействие протеомеров. А- механизм связывания кислорода гемом; Б — график насыщения гемоглобина и миоглобина в зависимости от парциального давления кислорода

Пептидных перемычек между доменами может быть и две. Изложенные представления позволяют понять механизм точечных мутаций. Точечные мутации предполагают замену одного нуклеотида гена на другой с изменением кода и, следовательно, с заменой одной из аминокислот полипептида. Последствия этой замены могут быть самыми разными и зависят от:

1. Различий свойств R-групп (гидрофобность, заряд, размер, жесткость цепи, способности образовывать водородные или дисульфидные связи). В зависимости от этого может произойти (а может и не произойти) существенное изменение вторичной, третичной или четвертичной структуры.

2. «Ответственности» участка цепи, в котором произошла замена аминокислоты, — наиболее критическими являются активный центр и точки перегибов.

Замена только одной аминокислоты в 6-м положении полипептидной последовательности гемоглобина (глутамата на валин) приводит к тяжелому заболеванию — серповидноклеточной анемии. На поверхности глобулы появляется «липкий» гидрофобный участок, в результате дезоксигемоглобин А слипается и образует аномально длинные нитевидные агрегаты, которые и обуславливают серповидную форму эритроцитов. Физические характеристики белка как полимера полностью определяются его способностью формировать компактную глобулу, от особенностей которой зависит и олигомеризация многих белков. Химические и функциональные свойства белков зависят от специфических взаимодействий функциональных групп, сближенных в его пространственной структуре. Вследствие этого поведение этих групп коренным образом отличается от их реакционной способности в аминокислотах и небольших пептидах. Белок может функционировать, то есть выступать в роли фермента, структурного или транспортного белка, регулятора, токсина, ингибитора только потому, что он обладает вполне определенным пространственным строением молекулы гидрофобных радикалов.

Как описано выше гомологичные белки — это белки выполняющие одинаковую функцию у разных организмов. Если несколько форм одного белка присутствуют в одном организме и/или у представителей одного вида, различающихся активностью, то их называют изофункциональными белками или изобелками. Так, у взрослого человека в крови содержится 96% HbA и по 2% HbF и HbA2. Все являются тетрамерами, протомеры представлены 4 формами: α, β, γ и Δ. Структура перечисленных видов гемоглобинов соответственно: α2β2, α2γ2 и α2Δ2. Очень мало отличаются по первичной, вторичной и третичной структурам, выполняют одну функцию, однако отличаются по сродству к кислороду. HbF имеет большее сродство к кислороду по сравнению с HbA и может отнимать кислород от HbA:

HbAО₂ + HbF ↔ HbA+ HbFО₂.

HbF характерен для эмбриональной стадии развития человека. Существование этих двух изобелков позволяет переносить кислород к эмбриону из крови матери в условиях несвязанных между собой кровеносных систем. Изобелки и гомологичные белки — разные понятия, гомологичные белки принадлежат организмам разных видов.

Множественность форм белков возникает в силу ряда причин, которые можно разделить на две категории. К первой относятся причины генетического уровня: в организме имеются множественные гены, каждый из которых кодирует свою субъединицу олигомерного белка. Ко второй категории относятся причины пострансляционного уровня; в этом случае различия между субъединицами, кодируемые одним геном, возникают из-за различных модификаций исходно гомогенных единиц. В свою очередь имеются два вида множественности генов: 1) множественные аллели в одном локусе, 2) множественные генные локусы.

В диплоидном геноме каждый генный локус дублирован. В отношении каждого локуса особь может быть гетерозиготной, т. е. обладающей разными аллелями. Если данный локус кодирует какую-то субъединицу фермента, то у гомозиготных особей синтезируются субъединицы только одного типа. Соответственно у гетерозиготных особей должны синтезироваться субъединицы двух разных типов. Понятно, что у отдельной особи множественность аллелей не может обеспечить большое разнообразие форм белков, поскольку число аллелей в диплоидном локусе не превышает двух. Однако в генофонде в целом число аллелей может быть достаточно велико, и поэтому при сравнении различных особей вероятна значительная вариабельность типов ферментных единиц. Различия между субъединицами, кодируемыми различными аллелями одного гена, обычно невелики; так возможны замены отдельных аминокислот, обусловленные точечными мутациями в нуклеотидных последовательностях ДНК. Если генный локус активен, то, как правило, функционируют оба аллеля. Вследствие этого, несмотря на большие колебания общей активности фермента в зависимости от вида клетки, у каждой особи изоферментный профиль остается постоянным: у гомозиготных особей субъединицы всегда одного типа, а у гетерозиготных — двух. Многие белки кодируются не одним, а несколькими генами, в этом случае каждому локусу будет соответствовать своя субъединица фермента.

Поскольку экспрессия каждого генного локуса регулируется независимо, в одних клетках организма могут синтезироваться субъединицы одного типа, а в других — другого. Более того, экспрессия генных локусов нередко меняется в процессе развития организма, и соответственно меняются типы субъединиц, образующихся в ткани. Таким образом, благодаря множественности генных локусов возможно изменение изоферментного профиля от ткани к ткани, а также в одной и той же ткани по мере роста и развития. Такое изменение изоферментного профиля невозможно, если возникновение изоформ обусловлено наличием различных аллелей в одном локусе. Поскольку все особи одного вида имеют одни и те же генные локусы, множество кодирующих белки локусов при отсутствии множественности аллелей не могла бы обеспечить различий в изоферментном спектре между отдельными особями вида.

Субъединицы белков, соответствующих разным локусам, как правило, сильно отличаются друг от друга (множественные замены аминокислот, делеции, вставки), что может отражаться в размерах субъединиц. Чтобы понять, каким образом на основе двоякой множественности генов возникают изобелки. Вернемся к примеру гемоглобина человека. Он существует в виде нескольких хорошо изученных молекулярных форм, которые образуются в результате множественности как генных локусов, так и аллелей.

Гемоглобин кодируется восемью различными генными локусами, каждый из которых определяет образование своей субъединицы. Полипептидные последовательности субъединиц очень похожи, хотя много замен аминокислот. Так, в α- и β-субъединицах различаются примерно 50% аминокислотных остатков, кроме того, несколько различна длина полипептидов (в α-субъединице — 141 остаток, в β-, γ- и δ-субъединицах — 146). По мере развития организма от раннего эмбрионального периода до детского возраста состав гемоглобинов качественно изменяется, что связано с изменением активности отдельных генных локусов. Так, гемоглобин новорожденного имеет состав α2γ2, но спустя несколько месяцев он замещается гемоглобином α2β2, так как активируется локус β вместо локуса γ.

Существуют и необычные гемоглобины, обусловленные наличием редких аллелей, причем их список постоянно растет. Наиболее распространен и изучен ген серповидноклеточной анемии, Он представляет собой аллель локуса гемоглобина β. Кодируемый им полипептид отличается от нормальной β-цепи только одной аминокислотой, а именно в нем в 6-м положении вместо глутамата стоит валин. Даже в тех районах земного шара, где часто встречается ген серповидноклеточной анемии, профили гемоглобинов у отдельных лиц различаются в зависимости от того, гомозиготны ли эти лица по нормальному аллелю, по гену серповидноклеточной анемии или же гетерозиготны. Синтезирующиеся в организме белки могут подвергаться модификациям: присоединению углеводов, ограниченному протеолизу или ковалентной модификации боковых групп аминокислот. Если посттрансляционным модификациям подвергается не вся популяция субъединиц, а только ее часть, то в организме будут присутствовать и модифицированные и немодифицированные субъединицы, то есть возникают изоферменты. примером может служить микрогетерогенность мышечной альдолазы.

У позвоночных альдолаза кодируется тремя генными локусами, и хотя в мышцах проявляет активность один локус А, из этой ткани можно выделить субъединицы двух типов: Аα и Аβ. Оказалось, что собственно продуктом трансляции является полипептид Аα, но он медленно превращается в Аβ вследствие того, что дезаминируется остаток аспарагина вблизи карбоксильного конца цепи. Когда процессы пострансляционной модификации в одних тканях намного активнее, чем в других, возникает тканеспецифичное распределение вторичных изоферментов, внешне сходное с эффектом множественности генных локусов. Рассмотрим субъединицы пируваткиназы. У млекопитающих субъединицы этого фермента бывают трех основных типов, каждый из которых отвечает независимому генному локусу. Субъединицы типа L (обозначаемые также тип I) есть в печени и в эритроцитах, однако изоферменты типа L из этих двух источников несколько различаются по величине и электрофоретической подвижности. Первоначально предполагалось, что синтез несколько большей по размеру субъединицы типа L`, присутствующий в эритроцитах, обусловлен четвертым генным локусом. Однако вспоследствие выяснилось, что дело в пострансляционной модификации. Во всех тканях первичным продуктом генного локуса L является субъединица типа L`, но в печени они быстро расщепляются протеолитическими ферментами с образованием субъединиц типа L. В эритроцитах этот процесс идет медленнее. Пируваткиназа играет важную роль в регуляции гликолиза, а субъединицы типов L и L` отличаются по своим регуляторным свойствам, что имеет, по-видимому, определенный физиологический смысл. Предложено термин «изофермент» употреблять только в отношении множественности форм, обусловленной генетическими причинами, и не применять в тех случаях, когда она обусловлена посттрансляционными модификациями.

Многие ферменты существуют в виде олигомеров, состоящих из нескольких субъединиц; очень часто встречаются димеры и тримеры. Если в клетке имеются субъединицы двух или нескольких типов и разные субъединицы способны соединяться друг с другом в любых комбинациях, то возникает целый набор изоферментов. В рассмотренных примерах образование изоформ обусловлено наличием 2 генных локусов. Если же в клетках присутствуют субъединицы не двух, а большего числа типов, то сложность набора изобелков возрастает. Так, например, у большинства видов позвоночных имеются субъединицы лактатдегидрогеназы трех типов — А, В и С; при случайной комбинации их в тетрамеры может образоваться 15 изоферментов, из них 12 гибридных. Сложность еще больше возрастает, если к множеству локусов добавятся аллельные вариации. Так, в случае лактатдегидрогеназы позвоночных обнаружены варианты аллелей, кодирующих субъединицы А и В. В организме, гетерозиготном по этим вариантам, будут синтезироваться пять различных субъединиц лактатдегидрогеназы: А, А`, В, В` и С. Следовательно, возможно образование 70 тетрамерных изоферментов.

К счастью для исследователя, сложность наборов изоферментов нередко оказывается ограниченной: реально образуются отнюдь не все возможные гибридные варианты. Чаще всего это происходит потому, что в клетке одновременно функционируют не все генные локусы, экспрессия некоторых генов крайне ограничена. Так, С-субъединица лактатдегидрогеназы синтезируется только в первичных сперматоцитах, где не обнаружено субъединиц А и В. Вследствие такого разделения in vivo не встречаются гибридные изоферменты, содержащие С-субъединицу.