Структурная биохимия - Учебное пособие - Е. А. Бессолицына 2015

Нуклеотиды принимают участие во множестве биохимических процессов, а также являются мономерами нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты обеспечивают все генетические процессы. Каждый нуклеотид состоит из трех типов химических молекул:

✵ азотистое основание;

✵ моносахарид;

✵ 1—3 остатка фосфорной кислоты.

В отличие от моносахаридов, нуклеотиды как мономеры являются сложно устроенными молекулами, состоящими из структур, относящихся к разным классам химических веществ, поэтому необходимо рассмотреть свойства и структуру этих компонентов по отдельности.

Азотистые основания относятся к гетероциклическим соединениям. В состав гетероцикла помимо атомов углерода входят атомы азота. Все азотистые основания, входящие в нуклеотиды относят к двум классам азотистых оснований: пуриновые и пиримидиновые. Пуриновые основания это производные пурина — гетероцикла, состоящего из двух циклов, один пятичленный, второй — шести, нумерация осуществляется так, как показано на рисунке. Пиримидиновые основания являются производными пиримидина и состоят из одного шестичленного цикла, нумерация также указана на рисунке (Рисунок 31). Главные пиримидиновые основания и у прокариот, и у эукариот — это цитозин, тимин и урацил. Из пуриновых оснований чаще всего встречаются аденин и гуанин. Два других — ксантин и гипоксантин — являются интермедиатами в процессах их метаболизма. У человека в роли конечного продукта катаболизма пуринов выступает окисленное пуриновое основание — мочевая кислота. Помимо пяти названных выше главных оснований известны и менее широко представленные минорные основания. Некоторые из них присутствуют только в нуклеиновых кислотах бактерий и вирусов, но многие также найдены в составе про- и эукариотических ДНК и транспортных и рибосомных РНК. Так, и бактериальная ДНК, и ДНК человека содержат значительные количества 5-метилцитозина; в бактериофагах обнаружен 5-гидроксиметилцитозин. Необычные основания выявлены в матричной РНК — N⁶-метиладенин, N⁶, N⁶-диметиладенин и N⁷-Meтилгуанин. У бактерий также обнаружен модифицированный урацил с присоединенной по N₃-положению (α-амино, α-карбокси) -пропильной группой. Функции этих замещенных пуринов и пиримидинов до конца не выяснены, однако они могут образовывать неканонические связи между основаниями (это будет рассмотрено ниже), обеспечивая образование вторичных и третичных структур нуклеиновых кислот.

Рисунок 31. Структура азотистых оснований

В клетках растений выявлена серия пуриновых оснований с метильными заместителями. Многие из них фармакологически активны. В качестве примера можно привести кофейные зерна, содержащие кофеин (1,3, 7-триметилксантин), чайный лист, содержащий теофиллин (1, 3-диметил-ксантин), и какао-бобы, в состав которых входит теобромин (3, 7-диметилксантин).

Молекула азотистого основания образует систему чередующихся одинарных и двойных связей (систему сопряженных двойных связей). Такая организация образует жесткую молекулу, без возможности конформационных переходов. В результате нельзя говорить об изменении конформации азотистых оснований.

Для азотистых оснований выявлен только один тип изомерии кето-енольный переход или таутомерия.

Таутомерия

Благодаря феномену кето-енольной таутомерии нуклеотиды могут существовать либо в лактимной, либо в лактамной формах, причем в физиологических условиях лактамная форма превалирует у гуанина и тимина (Рисунок 32). Важность этого обстоятельства станет ясна при обсуждении процессов спаривания оснований.

Рисунок 32. Таутомерия нуклеотидов

Растворимость

При нейтральном рН наименьшей растворимостью обладает гуанин. Следующим в этом ряду стоит ксантин. Мочевая кислота в форме уратов сравнительно неплохо растворяется при нейтральном рН, но очень плохо растворима в жидкостях с более низкими значениями рН, таких, как моча. Гуанин в моче человека в норме отсутствует, а ксантин и мочевая кислота являются ее обычными компонентами. Последние два пурина часто входят в состав камней мочевого тракта.

Поглощение света

За счет системы сопряженных двойных связей все азотистые основания поглощают в ультрафиолетовой части спектра. Спектр поглощения — график распределения оптической плотности в зависимости от длины волны. Для каждого азотистого основания свой спектр поглощения, по нему можно различить растворы различных азотистых оснований или соединений в состав которых входит азотистое основание (нуклеотиды), но максимум поглощения у всех совпадает при длине волны 260 нм. Это позволяет легко и быстро определять концентрацию как азотистых оснований, так нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Спектр поглощения также зависит от рН раствора (Рисунок 33).

Рисунок 33. Спектры поглощения различных азотистых оснований

Азотистые основания практически не встречаются в свободном состоянии. Исключение составляют некоторые алкалоиды и мочевая кислота.

Азотистые основания выполняют следующие функции:

Входят в состав нуклеотидов;

Часть алкалоидов — азотистые основания, например, кофеин в кофе или теофелин в чае;

Промежуточные продукты обмена азотистых оснований и нуклеотидов;

Мочевая кислота — причина мочекаменной болезни;

В виде мочевой кислоты выводится азот у некоторых организмов.

Молекулы нуклеозидов построены из пуринового или пиримидинового основания, к которому (β-связью присоединен углевод (обычно D-рибоза или 2-дезоксирибоза) в N₉ или N₁‒положении соответственно. Таким образом, адениновый рибонуклеозид (аденозин) состоит из аденина и D-рибозы, присоединенной в положении N₉; гуанозин — из гуанина и D-рибозы в положении N₉; цитидин — из цитозина и рибозы в положении N₁; уридин — из урацила и рибозы в положении N₁. Таким образом в пуриновых нуклеозидах (нуклеотидах) азотистое основание и сахар связаны 1—9 β гликозидной связью, а в пиримидинах — 1—1 β гликозидной связью.

В состав 2́-дезоксирибонуклеозидов входят пуриновые или пиримидиновые основания и 2́-дезоксирибоза, присоединенная по тем же атомам N₁ и N₉. Присоединение рибозы или 2́-дезоксирибозы к кольцевой структуре основания происходит за счет относительно кислотолабильной N-гликозидной связи (Рисунок 34).

Нуклеотиды — это производные нуклеозидов, фосфорилированные по одной или более гидроксильным группам остатка рибозы (или дезоксирибозы). Так, аденозинмонофосфат (AMФ или аденилат) построен из аденина, рибозы и фосфата. 2́-дезоксиаденозинмонофосфат (дAMФ или дезоксиаденилат) представляет собой молекулу, состоящую из аденина, 2́-дезоксирибозы и фосфата. Обычно к урацилу присоединена рибоза, к тимину — 2́-дезоксирибоза. Поэтому тимидиловая кислота (ТМФ) состоит из тимина, 2́-дезоксирибозы и фосфата. Кроме вышеперечисленных форм нуклеотидов обнаружены и нуклеотиды необычной структуры. Так, в молекуле тРНК выявлен нуклеотид, в котором рибоза присоединяется к урацилу в пятом положении, т. е. не азот-углеродной связью, а углерод-углеродной. Продукт этого необычного присоединения назван псевдоуридином (ψ). Молекулы тРНК содержат и другую необычную нуклеотидную структуру — тимин, соединенный с рибозомонофосфатом. Этот нуклеотид образуется уже после синтеза молекулы тРНК путем метилирования остатка УMФ S-аденозилметионином. Псевдоуридиловая кислота (ψМФ) тоже образуется в результате перегруппировки УMФ после синтеза тРНК.

Рисунок 34. Структура пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и нуклеотидов

Положение фосфатной группы в молекуле нуклеотида указывается цифрой. Например, аденозин с фосфатной группой, присоединенной к 3-му углероду рибозы, должен быть обозначен как 3́-монофосфат. Штрих после цифры ставят для того, чтобы отличить номер углерода в пуриновом или пиримидиновом основании от положения этого атома в остатке дезоксирибозы. При нумерации атомов углерода основания штрих не ставится. Нуклеотид 2́-дезоксиаденозин с фосфатным остатком при углероде-5 молекулы сахара обозначается как 2́-дезоксиаденозин-5́-монофосфат. Нуклеозиды, содержащие аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил, принято обозначать буквами A, Г, Ц, Т и У соответственно. Наличие буквы d (или д) перед сокращением обозначает, что углеводным компонентом нуклеозида является 2́-дезоксирибоза. Гуанозин, содержащий 2́-дезоксирибозу, может быть обозначен дГ (дезоксигуанозин), а соответствующий ему монофосфат с фосфатной группой, присоединенной к третьему атому углерода дезоксирибозы, — дГ-3́-МФ. Как правило, в тех случаях, когда фосфат присоединен к углероду-5 рибозы или дезоксирибозы, символ 5́ опускается. Так, гуанозин 5́-монофосфат принято обозначать ГМФ, а 5́-монофосфат 2́-дезоксигуанозина сокращают как дГМФ. Если к углеводному остатку нуклеозида присоединены 2 или 3 остатка фосфорной кислоты используются аббревиатуры ДФ (дифосфат) и ТФ (трифосфат). Таким образом, аденозин + трифосфат с тремя фосфатными группами в 5́-положении углевода будет обозначаться АТФ. Поскольку в молекулах нуклеотидов фосфаты находятся в виде ангидридов фосфорной кислоты, т. е. в состоянии с низкой энтропией, их называют макроэргами (обладающими большим запасом потенциальной энергии). При гидролизе 1 моля АТФ до AДФ высвобождается 7,3 кКал потенциальной энергии.

Рисунок 35. Структура цАМФ

Физико-химические свойства нуклеотидов

Так как в состав нуклеотидов входят азотистые основания, то такие свойства как таутомерия и способность поглощать в ультрафиолетовой части спектра также характерны и для нуклеотидов, причем спектры поглощения азотистых оснований и содержащих эти основания нуклеотидов сходны. Наличие сахара и остатков фосфорной кислоты делает их более гидрофильными чем азотистые основания. Все нуклеотиды являются кислотами, так как содержат остатки фосфорной кислоты.

Функции природных нуклеотидов

Нуклеотиды являются мономерами нуклеиновых кислот (РНК, ДНК). В состав ДНК входят дезоксирибонуклеотидфосфаты — производные аденина, тимина, гуанина и цитозина. Также некоторые молекулы гуанина и цитозина в составе ДНК метилированы, то есть содержат метильную группу. Как основные мономеры в состав РНК входят рибонуклеотидфосфаты — производные аденина, урацила, гуанина и цитозина. Также в состав РНК входят нуклеотиды, содержащие различные минорные азотистые основания, например ксантин, гипоксантин, дигидроуридин и др.

Нуклеотиды являются мономерами коферментов (НАД, НАДФ, ФАД, ко-энзим А, метионин-аденозин). В составе коферементов они участвуют в ферментативных реакциях. Более подробно эта функция будет рассмотрена ниже.

Энергетическая (АТФ). АТФ выполняет функцию основного внутриклеточного переносчика свободной энергии. Концентрация наиболее распространенного свободного нуклеотида в клетках млекопитающих — АТФ — составляет около 1 ммоль/л.

Сигнальная (цГМФ, цАМФ) (Рисунок 35). Циклический AMФ (3́-, 5́-аденозинмонофосфат, цАМФ) — медиатор различных внеклеточных сигналов в клетках животных — образуется из АТФ в результате реакции, катализируемой аденилатциклазой. Активность аденилатциклазы регулируется комплексом взаимодействий, многие из которых инициируются через рецепторы гормонов. Внутриклеточная концентрация цАМФ (около 1 мкмоль/л) на 3 порядка ниже концентрации ATФ. Циклический цГМФ (3́-, 5́-гуанозинмонофосфат, цГМФ) служит внутриклеточным проводником внеклеточных сигналов. В некоторых случаях цГМФ выступает в роли антагониста цАМФ. цГМФ образуется из ГТФ под действием гуанилатциклазы — фермента, имеющего много общего с аденилатциклазой. Гуанилатциклаза, как и аденилатциклаза, регулируется различными эффекторами, в том числе и гормонами. Как и цАМФ, цГМФ гидролизуется фосфодиэстеразой до соответствующего 5́-монофосфата.

Регуляторная (ГТФ). Активность группы белков (G-белков), выполняющих в основном регуляторную функцию, зависит от того: какой нуклеотид они связывают. В неактивной форме эти белки связывают ГДФ, при активации белка происходит замена ГДФ на ГТФ. При выполнении своей функции белок гидролизует ГТФ до ГДФ и фосфата, выделившаяся, энергия затрачивается на функционирование белка.

Активация при метаболизме липидов и моносахаридов (УТФ, СТФ). Производные урациловых нуклеотидов участвуют в качестве активирующих агентов в реакциях метаболизма гексоз и полимеризации углеводов, в частности при биосинтезе крахмала и олигосахаридных фрагментов гликопротеинов и протеогликанов. Субстратами в этих реакциях являются уридин-дифосфатсахара. Например, уридиндифосфатглюкоза служит предшественником гликогена. Также превращение глюкозы в галактозу, глюкуроновую кислоту или другие производные моносахаридов происходит в виде коньюгата с УДФ. СТР необходим для биосинтеза некоторых фосфоглицеридов в тканях животных. Реакции с участием церамида и ЦДФ-холина приводят к образованию сфингомиелина и других замещенных сфингозинов.

Участие в дезактивации различных спиртов и фенолов (УДФ-глюкуроновая кислота). Уридиндифосфатглюкуроновая кислота — выполняет функцию «активного» глюкуронида в реакциях конъюгирования, например, при образовании глюкуронида билирубина.

Коферменты — это низкомолекулярные соединения связанные с ферментами (см раздел «Ферменты») непосредственно участвующие в в биохимической реакции, другими словами это еще один субстрат, не выходящий в окружающую среду.

Коферменты подразделяют на две группы:

переносчики протонов и электронов, эти коферменты участвуют в окислительно-восстановительных реакциях;

переносчики всех остальных групп кроме протонов и электронов, эти коферменты участвуют в трансферазных реакциях.

Более подробно механизмы упомянутых реакций можно рассмотреть в главе «Ферменты».

Некоторые коферменты содержат в своем составе нуклеотиды. Они также делятся на эти же две группы.

Эти коферменты участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, где аденозин выполняет только структурную функцию, в реакцию вступают нуклеотиды, содержащие другие типы оснований, выделяют два типа таких коферментов: никотиновые и флавиновые. Они отличаются не только по активной группировке, но и по типу реакций, которые они осуществляют.

Никотиновые коферменты

Рисунок 36. Никотиновые коферменты. А-структура NAD, Б-структура NADP, В-механизм активности никотиновой кислоты, Г-механизм работы никотиновых коферментов

Никотинамидадениндинуклеотид (NAD⁺) — главный акцептор электронов при окислении топливных молекул. Реакционноспособная часть NAD⁺ — его никотинамидное кольцо. При окислении субстрата никотинамидное кольцо NAD⁺ присоединяет ион водорода и два электрона, которые являются эквивалентами гидрид-иона. Восстановленная форма этого переносчика — NADH. В ходе этого дегидрирования один атом водорода субстрата прямо переносится на NAD⁺, тогда как второй переходит в растворитель. Оба электрона, теряемые субстратом, переносятся на никотинамидное кольцо. Роль донора электронов в большинстве процессов восстановительного биосинтеза (пластического обмена); выполняет восстановленная форма никотин амидадениндинуклеотидфосфата (NADPH). NADPH отличается от NAD наличием фосфата, связанного эфирной связью с 2́-гидроксильной группой аденозина. Окисленная форма NADPH обозначается как NADP⁺. NADPH переносит электроны таким же образом, как NADH. Однако, NADPH используется почти исключительно в процессах восстановительного биосинтеза, тогда как NADH используется преимущественно для генерирования АТР. Дополнительная фосфатная группа NADPH — это участок, ответственный за осуществление целевого предназначения молекулы, состоящего в распознавании ферментами.

Флавиновые коферменты

Первый флавиновый кофермент (флавинмононуклеотид FMN) был выделен А. Сент-Дьёрдьи из сердечной мышцы в 1932 г., Р. Г. Варбург и В. Христиан тогда же получили из дрожжей первый флавопротеид, содержащий FMN в качестве кофермента. Второй важнейший флавиновый кофермент — флавинадениндинуклеотид (FAD) выделен ими же как кофактор оксидазы D-аминокислот в 1938 году. За счет окислительно-восстановительного превращения флавинового кольца флавиновые коферменты осуществляют окислительно-восстановительные реакции в составе многих важнейших ферментных систем: оксидаз (в частности, оксидаз D- и L-аминокислот, моноаминооксидазы, регулирующей уровень катехоламинов в крови) и дегидрогеназ (часто с участием никотинамидадениндинуклеотида и убихинонов).

Рисунок 37. Флавиновые коферменты. А-структура FAD, Б-механизм активности никотиновой кислоты, В-механизм работы флавиновых коферментов

Второй основной переносчик электронов при окислении топливных молекул — флавинадениндинуклеотид. Сокращения, используемые для обозначения окисленной и восстановленной форм этого переносчика — соответственно FAD и FADH₂. Реакционноспособная часть FAD — это его изоаллоксазиновое кольцо. FAD, подобно NAD⁺, присоединяет два электрона. Однако FAD в отличие от NAD⁺ присоединяет оба теряемых субстратом атома водорода.

Флавиновые коферменты участвуют в окислении углеродного скелета обеспечивая введения двойных связей между атомами углерода (Рисунок 37), также флавиновые коферменты участвуют в окислительно-восстановительных реакциях в составе электрон-транспортных цепей фотосинтеза и окислительного фосфорилирования.

Эти коферменты участвуют в переносе любых групп кроме протонов и электронов, такие реакции называют трансферазными. Таких коферментов множество, рассмотрены будут только отельные коферменты.

Кофермент А — молекула, занимающая центральное место в метаболизме (Рисунок 38). В 1945 г, Липман установил, что для многих процессов ацеллирования, катализируемых ферментами, требуется термостабильный кофактор. Этот кофактор был назван коферментом А (СоА), где А означает ацетилирование. Он был выделен, а несколькими годами позднее была определена его структура. Реакционноспособной частью молекулы СоА является концевая сульфгидрильная группа пантотеновой кислоты. Ацильные группы присоединяются к СоА при помощи тиоэфирной связи. Образующееся в результате этого производное получило название ацил-СоА. Ацильная группа, связанная с СоА, часто бывает представлена ацетильной группой. Это производное называют ацетил-СоА. Другими словами, ацетил-СоА имеет высокий потенциал переноса ацетильных групп. Со А является переносчиком активированных ацетильных или других ацильных групп, подобно тому, как АТФ служит переносчиком активированных фосфорильных групп.

Рисунок 38. Структурные формулы коферментов, переносящих другие группы. А — коэнзим А, Б — S-аденозинметионин

S-аденозил метионин — это кофермент, принимающий участие в реакциях переноса метильных групп (Рисунок 38). Впервые был описан в Италии ученым Кантони в 1952 году. S-аденозилметионин образуется из АТФ и метионина ферментом метионин аденозилтрансферазой. В клетке участвует в таких метаболических путях, как трансметилирование, транссульфирование и аминопролилирование. И хотя эти анаболические реакции идут в многих тканях организма, большая часть S-аденозилметионина образуется в печени.

Метильная группа (CH₃), которая присоединена к атомы серы в молекуле метионина в составе S-аденозилметионина является химически активной. Поэтому метильная группа может быть перенесена на молекулу субстрата в трансметилазной реакции. Более сорока метаболических реакций требуют переноса метильной группы от S-аденозилметионина на такие субстраты, как нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Аденозилметионин участвует в синтезе фосфатидилхолина, холина, адреналина, витамина В₁₂ и др. Механизм трансметилирования — замещения под действием ферментов группы метилтрансфераз, специфичных к акцепторам метильной группы. Метилируются обычно атомы N и О, реже-С.

Перенос метильных групп на двойные связи ненасыщенных жирных кислот микроорганизмов приводит к образованию кислот с разветвленной цепью или содержащих циклопропановые кольца. В результате метилирования некоторых биологически активных соединений (например, гистамина, никотинамида) образуются продукты, выводимые из организма. В белках метилированию могут подвергаться аминогруппы остатков лизина и аргинина. Метилирование пуриновых и пиримидиновых оснований, а также рибозных колец — самая распространенная модификация нуклеиновых к-т, особенно транспортных РНК. В полисахаридах аденозилметионин может, напр., метилировать атом О в положении 6 остатков D-глюкозы.

При элиминировании метильной группы аденозилметионин превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин, который гидролизуется до аденозина и гомоцистеина. Последний может быть в организме метилирован при участии N₅-метилтетрагидрофолиевой кислоты с образованием метионина, который вновь может включаться в состав аденозилметионина Известны и другие пути метаболизма S-аденозил-L-гомоцистеина: у млекопитающих — расщепление с образованием гомосерина, аденина и 5-метилтиорибозо-1-фосфата, у микроорганизмов-дезаминирование аденозинового или гомоцистеинового фрагментов молекулы, а также отщепление аденина.

Аденозилметионин служит также донором аминопропильных фрагментов при биосинтезе аминов-спермина, и спермидина, а также донором аминогруппы при синтезе биотина. Установлена регуляторная функция аденозилметионина для некоторых ферментов: воздействие аденозилметионина на одну из субъединиц фермента (напр., в результате переноса аденозильного остатка) меняет сродство к субстрату у другой.

По мимо этого метилазы, содержащие S-аденозин метионин в качестве кофермента, участвуют в модификациях ДНК, которые запускают процессы перехода в гетерохроматин и изменяют сродство РНК-полимеразы к промоторам. Именно эти процессы метилирования и деметилирования влияют на активность хроматина и регуляцию активности ДНК. Таким образом метилазы влияют на реализацию генетической информации.

Молекула НК (нуклеиновой кислоты) высокомолекулярное соединение, мономером которого является нуклеотид. Рибоза и дезоксирибоза входят в состав НК в виде циклической формы. Нуклеотиды присоединяются через остатки фосфорной кислоты, в результате образуя сахаро-фосфатный остов, где остаток сахара чередуется с остатком фосфорной кислоты. Остаток фосфорной кислоты присоединяется к 3́-гидроксильной группы предыдущего сахара и 5́ -гидроксилом следующего. Молекула асимметрична, есть 5́ и 3́ концы, началом молекулы является 5́-конец, концом 3́, так как синтез молекул нуклеиновых кислот происходит от 5́ к 3́ концу. ДНК и РНК различаются прежде всего по молекулам пентозы, входящим их состав. В РНК входит рибоза, в ДНК — дезоксирибоза. Различие между этими пентозами заключается в наличии ОН группы в 2́ положении у рибозы. Эта группа обуславливает нестабильность и большую реакционную способность РНК (способность осуществлять катализ и реакции внутри молекулы). У — образуется в результате дезаминирования Ц, если бы это основание входило в состав ДНК точность репарации уменьшилась бы. Также существуют другие различия РНК и ДНК, которые представлены в таблице 1.

Рисунок 39. Первичная структура нуклеиновых кислот

Таблица 1. Различия между РНК и ДНК.

Первичная структура ДНК предполагает формирование следующего уровня организации, в данном случае — вторичной структуры ДНК.

Рисунок 40. В-форма ДНК. А-общий план структуры В-формы ДНК, Б-структура водородных связей между основаниями в ДНК

Вторичная структура ДНК представляет собой двухспиральную молекулу. Две спиральные полинуклеотидные цепи закручены вокруг общей оси. Цепи направлены в противоположные стороны, то есть антипараллельны. То есть 3́-конец одной цепи взаимодействует с 5́-концом другой цепи. Цепи правозакрученные.

Две цепи удерживаются вместе водородными связями между парами оснований. Аденин всегда спаривается с тимином, гуанин — с цитозином. Это обеспечивается принципом комплементарности — структурного и химического соответствия молекул друг другу. Аденозин в ДНК комплементарен тимину и между основаниями образуется две водородные связи. Гуанин комплементарен цитозину, образуя три водородные связи. Это возможно из-за жесткой структуры азотистых оснований.

Пуриновые и пиримидиновые основания расположены внутри спирали, а остатки фосфата и дезоксирибозы — снаружи. Плоскости оснований перпендикулярны оси спирали. Плоскости двух спаренных оснований образуют стопку. Между плоскостями образуются дополнительные связи между собой. Плоскости остатков сахара расположены почти под прямым углом к основаниям.

Диаметр спирали 20А. Расстояние между соседними основаниями вдоль оси спирали 3,4А, они повернуты относительно друг друга на 36°. Таким образом, на один виток спирали каждой из цепей приходится 10 нуклеотидов, что соответствует 34А.

На последовательность оснований в полинуклеотидной цепи не накладывается никаких ограничений. Определенная последовательность оснований несет конкретную генетическую информацию.

Описанная вторичная структура ДНК была расшифрована Уотсоном и Криком, это самая распространенная форма ДНК и она получила название В-формы. Существует несколько форм ДНК (Таблица 2).

Таблица 2. Формы вторичной структуры ДНК

Рисунок 41. Структура различных форм ДНК. А — структура основных форм ДНК; Б — структура Н-формы ДНК; В — структура неканонических худстиновских взаимодействий

РНК образована рибонуклеотидами, также состоящими из азотистого основания, пентозы и остатка фосфорной кислоты. Различия заключаются в том, что в РНК рибоза и составе азотистых оснований. Эти различия связаны с функциями РНК и ДНК. Наличие же рибозы в сахарофосфатном остове делает его менее стабильным (разрывы, накопление ошибок при передаче информации дочерним клеткам) но позволяет осуществлять каталитическую функцию. РНК в отличие от ДНК одноцепочечная и образует сложную вторичную и третичную структуры, что также позволяет осуществлять каталитическую функцию. Вторичные структуры РНК петля и спираль обеспечивают образование простых и сложных шпилек. Спирали РНК образованы комплементарными основаниями и по строению сходны с В-спиралью ДНК, то есть сходны по структуре с В-формой ДНК, различие в том что двойную спираль образуют не две отдельные цепи, а комплементарные и антипараллельные участки одной цепи РНК. Также следует отметить, что в образовании вторичной структуры РНК участвуют не только основные, но и минорные нуклеотиды, следовательно образуются как канонические, так и неканонические связи. Следует отметить, что образованные спирали короче, и составляют всего несколько десятков оснований и длина их зависит от длины комплементарных последовательностей нуклеотидов. Петли РНК представляют собой неспаренные основания. В спиралях РНК возможно наличие неспаренных оснований, которые образуют выпетливания.

Рисунок 42. Вторичная структура РНК. А-структура тРНК, Б-структура рРНК

Наиболее хорошо изучена вторичная структура тРНК, в виде структуры клеверного листа. В ней наблюдается три шпильки: антикодоновая, псевдоуридиновая и дигидроуриновая, также аминоакцепторный стебель и вариабельная петля. Вариабельная петля обеспечивает различия в длине молекул тРНК (Рисунок 42). РНК, принимая вторичную структуру, обеспечивает третичную, это более высокий уровень организации. В третичной структуре спирали или стебли взаимодействуют между собой или/и с одноцепочечными фрагментами или петлями, образуя более высоко организованные структуры. Также одной из форм третичной структуры является узел — в нем может участвовать несколько цепей РНК и взаимодействие обуславливается как комплементарными (Уотсон-Криковскими) так и худстиновскими взаимодействиями (аналогичные взаимодействия в Н-форме ДНК). Вторичная структура РНК обуславливает формирование третичной структуры, когда петли и шпильки образуют более сложную структуру взаимодействуя между собой. В ходе формирования третичной структуры тРНК образует L-образную структуру. Аминоакцепторный стебель и псевдоуридиновая шпилька взаимодействуют между собой образуя, образуя одну часть L-образной структуры, антикодоновая и дигидроуридиновая шпильки связываются вместе, образуя вторую часть. Вариабельная петля взаимодействует с ними в участке соединения, образуя узел и стабилизируя новые структуры.

Для определения типа нуклеиновой кислоты необходимо идентифицировать сахар. Наиболее часто применяемыми методами являются колориметрические; их можно использовать для количественного определения углеводов как таковых или, соответственно модифицировав методику, для определения нуклеиновых кислот, нуклеотидов и других производных.

Некоторые из методов определения пентозы основаны на высвобождении фурфурола после нагревания с НСl. Фурфурол дает красное окрашивание с ацетатом анилина или желтое окрашивание с π-бромфенилгидразином. Рибоза дает характерную окраску после реакции с орцином в соответствующих условиях.

Если ДНК нагревать с дифениламином в кислом растворе, то наблюдается синее окрашивание. При реакции Фойльгена дезоксирибоза или ДНК после частичного кислотного гитдролиза дают сине-фиолетовую окраску.

Молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, следовательно в электрическом поле будут двигаться к положительному электроду. Если обеспечить перемещение через среду с ячейками, то есть гель с определенным размером ячеек, то линейные молекулы нуклеиновых кислот будут проходить через ячейки. Чем больше молекула, тем больше времени ей необходимо для прохождения через ячейки геля, следовательно чем короче молекула нуклеиновой кислоты тем дальше она сможет уйти в геле по сравнению с более длинной. Это метод позволяет разделить смесь нуклеиновых кислот по длине, а также при наличии смеси фрагментов с известными размерами и определить длину исследуемых фрагментов (Рисунок 43).

Рисунок 43. Гель-электрофорез ДНК в агарозном геле. М — маркер (Смесь молекул ДНК с известной длиной)

Если концентрированные растворы хлорида цезия центрифугировать в аналитической ультрацентрифуге при высоких скоростях до установления равновесия между седиментацией и диффузией, создается стабильный градиент концентрации CsCl. Это соответствует увеличению плотности раствора в направлении центробежной силы. Формируемый градиент плотности пропорционален центробежной силе в соответствии с уравнением

dp/dr=aω²r,

где ρ — плотность, являющаяся функцией от радиуса r (расстояние от центра вращения), ω — угловая скорость и α — константа, зависящая от природы соли. Если раствор CsCl содержит небольшое количество ДНК, то в условиях равновесия молекулы ДНК собираются в полосы в тех зонах ячейки для центрифугирования, где их плотность и плотность среды равны (изопикничны). Положение ДНК в ячейке может быть установлено по поглощению в ультрафиолетовой области, регистрируемому с помощью фотографии. Точно вычислив градиент плотности раствора вдоль ячейки, можно найти плотность образца ДНК. Эта техника называется изопикническим центрифугированием в градиенте плотности. Плавучая плотность ДНК находится в эмпирической зависимости от содержания G+C в молекуле:

ρ (г/см³) = 1,660 +0.100 (содержание G + С)

Это свойство позволяет фракционировать молекулы ДНК по содержанию в них G+C, а также по размеру молекулы.

Денатурация — разрушение вторичной структуры за счет распада водородных связей. В результате двойные спирали ДНК и РНК разрушаются, и образуются статистические клубки одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот.

Чаще всего используют температурную, но может быть и химическая (денатурирующие агенты мочевина, формамид и формальдегид). Температурная денатурация происходит под действием тепловой энергии сообщаемой при нагревании, в результате увеличивается частота и энергия колебаний и слабые водородные связи разрушаются. При химической денатурации молекулы денатурирующего агента конкурируют за водородные связи и азотистые основания взаимодействуют не друг с другом, образуя вторичную структуру, а с денатурирующими агентами.

Температура при которой денатурирована половина молекул — температура плавления

Температура плавления зависит от длины молекулы и ее G/C состава, так как чем больше водородных связей нужно разорвать, тем больше энергии необходимо сообщить системе, а, следовательно, больше нагреть. Чем больше длина молекулы, тем больше нуклеотидов, образует вторичную структуру, а также больше водородных связей во вторичной структуре. При взаимодействии аденина с тимином две связи, гуанина с цитидином три, каждая пара G/C дает на одну связь больше, и увеличивается количество поглощенной энергии. Определение температуры плавления следует проводить при фиксированной ионной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК. Значение Т_пл можно снизить, добавляя мочевину — реагент, разрушающий водородные связи и препятствующий гидрофобным взаимодействиям. Например, в 8М мочевине Т_пл снижается до 20°С. В 95%-ном формамиде ДНК полностью разделяется на две нити при комнатной температуре. Аналогично в кислых растворах вблизи рН 2—3, при которых протонируются аминогруппы, спираль разрушается. Степень денатурированности ДНК определяется несколькими способами.

Все нуклеиновые кислоты сильно поглощают свет в УФ-области с максимумом 260 нм. Когда нативность ДНК нарушается, наблюдается заметный гиперхромный эффект — увеличение поглощения. Это изменение отражает уменьшение числа водородных связей и отмечается не только для ДНК, но и для РНК и синтетических полинуклеотидов, которые имеют стабилизируемую водородными связями структуру.

Нативная ДНК обладает сильным положительным вращением плоскости поляризации света, которая заметно уменьшается при денатурации.

Растворы нативной ДНК имеют высокую вязкость, что является следствием наличия относительно жесткой двуспиральной и вытянутой стержнеподобной структуры ДНК. Разрушение водородных связей приводит к заметному уменьшению вязкости.

Денатурация ДНК — процесс обратимый. Если ДНК только частично денатурирована, например, при нагревании, то при снижении температуры происходит быстрая ренатурация каждой молекулы ДНК, скорость которой соответствует реакции первого порядка. Если ДНК полностью денатурирована, две комплементарные нити будут реассоциировать медленно («отжиг» ДНК). Этот процесс включает две стадии: сначала по реакции второго порядка происходит сборка комплементарных последовательностей двух нитей, а затем по реакции первого порядка — быстрое их «защелкивание». Если начальная концентрация денатурированной ДНК — C₀ (молярная концентрация фосфата ДНК), то изменение концентрации С одноцепочечной ДНК во времени подчиняется уравнению реакции второго порядка

dc/dt — K₂C²

интегральная форма которого

С/C₀ = 1/ (1 +K2C₀t)

Скорость ренатурации обычно оценивается по графику зависимости С/С₀ от lgC_ot. Построив график, можно найти C₀ t_1/2, где t _1/2 — время, при котором С/С₀ = 0,5, а также константу скорости реакции второго порядка K₂, равную 1/C₀t_1/2. Константа K₂— характеристический параметр для данной ДНК; она обратно пропорциональна N — числу пар оснований ДНК (если ДНК не имеет повторяющихся последовательностей). C₀ t_1/2 прямо пропорционально N (N называется сложностью ДНК). Этот метод позволяет определить для бактериальных и вирусных ДНК значения N, согласующиеся со значениями, полученными другими методами.