БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004

25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

25.5. Трансгенные животные

25.5.1. Введение новых генов в организм животных

Один из первых успешных экспериментов по созданию трансгенных животных был осуществлен на мышах. В геном мыши был встроен ген, кодирующий гормон роста крысы, соединенный с сильным промотором, который стимулировался, если в рационе мышей присутствовали тяжелые металлы. Когда в корм мышей добавляли эти тяжелые металлы, ген гормона роста находился во включенном состоянии. В результате такие трансгенные мыши росли в 2—3 раза быстрее, чем их сородичи, не несущие чужого гена и достигали примерно в 2 раза больших размеров. В настоящее время при создании трансгенных животных используют пять основных методов: 1) введение ДНК в яйцеклетки; 2) введение ДНК в стволовые клетки; 3) введение ДНК с помощью векторов на основе вирусов; 4) непосредственное введение ДНК, стимулируемое кальцием или электрическим током (трансфекция); 5) введение ДНКс помощью липосом.

Микроинъекции в яйцеклетки

Если необходимо, чтобы все клетки животного содержали новый ген, этот ген нужно ввести в яйцеклетку. Сначала у самки с помощью гормональных препаратов стимулируют образование дополнительных яйцеклеток. Затем оплодотворенные яйцеклетки извлекают из организма матери и с помощью очень тонкой иглообразной пипетки под контролем микроскопа донорную ДНК вводят в один из пронуклеусов. Процесс введения изображен на рис. 25.16. В некоторых (но не во всех) случаях ДНК действительно встраивается в одну или несколько хромосом. Позднее два пронуклеуса сливаются, и яйцеклетка превращается в зиготу. Зиготы переносят в организм одной или нескольких приемных матерей (максимум, два потомка на одну мать), а потом проводят скрининг потомства на присутствие нового гена. Лучший результат, которого удалось добиться в настоящее время, — это одно трансгенное животное на каждые 20 обработанных яйцеклеток в случае овец или 100 яйцеклеток в случае коров. Следовательно, для проведения экспериментов нужно содержать большое стадо, что делает процесс получения трансгенных животных очень дорогостоящим. Первые опыты такого рода проводились на кроликах, свиньях и овцах, а за ними последовали крупный рогатый скот и рыбы.

Рис. 25.16. Микроинъекция ДНК в яйцеклетку. Ядра мужской и женской гамет еще не слились и на этой стадии называются пронуклеусами. Они видны в центре яйцеклетки. ДНК вводят в один из пронуклеусов с помощью очень тонкой иглообразной пипетки (справа на фотографии). Яйцеклетку придерживают в устойчивом состоянии с помощью другой пипетки (слева). В яйцеклетку вводят несколько сотен копий фрагмента ДНК.

Использование стволовых клеток

В настоящее время все более популярным становится процесс, который является более контролируемым по сравнению с описанным выше. Из раннего зародыша берут несколько клеток, называемых стволовыми, и размножают, помещая на питательную среду. ДНК вводят в эти клетки различными способами, в том числе с помощью микроинъекции. Преимущество данного метода состоит в том, что клетки, в которых экспрессируется новый ген (т. е. трансформированные клетки), можно идентифицировать до того, как они будут возвращены в материнский организм. Таким образом предупреждается рождение нежелательного нетрансгенного потомства. По-видимому, со временем станет возможным встраивать гены в специфические участки хромосом, что необходимо для их нормальной экспрессии. Это станет особенно важным, если метод будет когда-нибудь испытываться на людях.

Успешно трансформированные клетки возвращают обратно в нормальный зародыш, и они становятся его частью. Развившееся животное представляет собой смесь двух генетически различающихся типов клеток, часть которых произошла от нормальных стволовых клеток, а часть — от трансформированных. Таких животных называют химерами (по названию мифологического животного с головой льва, телом козла и хвостом змеи). Половые клетки химер также будут смешанными, и некоторые из гамет будут нести новый ген. Они дадут начало полностью трансгенным животным в следующем поколении.

Векторы на основе вирусов

В принципе это тот же метод, который используется при работе с фаговыми векторами в случае бактерий. Плазмидные векторы нельзя использовать, так как клетки животных не содержат плазмид. Метод не применяют на яйцеклетках, а используют только в тех случаях, когда нужно трансформировать некоторые клетки организма, например при генной терапии (разд. 25.7.11).

Прямое поглощение ДНК

В правильно подобранных условиях фрагменты ДНК могут быть поглощены клеткой с помощью фагоцитоза. Этот процесс более эффективен, если ДНК приготовлена в присутствии фосфата кальция. Данный метод подходит для генной терапии, когда необходимо модифицировать только некоторые клетки в организме. Можно использовать альтернативный процесс, называемый электропорацией, когда клетки стимулируют кратковременным импульсом слабого электрического тока. При этом в клеточной мембране образуются временные отверстия (поры), и она становится проницаемой для ДНК.

Липосомы

Липосомы представляют собой искусственно созданные сферы (пузырьки), окруженные подобно мембране фосфолипидным бислоем. ДНК, которую необходимо ввести в клетки, содержится в липосомах. Липосомы слипаются с клетками и проникают в них (см. разд. 25.7.11).