БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004
25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА
25.7. Генетика человека
25.7.12. Генетическая дактилоскопия и генотипирование
Метод генетической дактилоскопии был разработан Алеком Джеффризом (Alec Jeffreys) и его коллегами в 1984 г. в Лестерском университете. Более поздний и более чувствительный вариант этого метода известен как генотипирование. Метод получил известность среди населения благодаря его использованию в громких уголовных делах, таких как дело футболиста О. Дж. Симпсона в США в 1995 г.
В геноме человека содержится около 100 000 генов (по последним данным их существенно меньше). Гены кодируют белки, однако около 95% ДНК является некодирующей. Функция такой ДНК пока неизвестна, но возможно, она участвует в формировании правильной структуры хромосом в клетке. Около 30—40% такой ДНК представлена короткими последовательностями оснований, которые многократно повторяются. Некоторые из повторяющихся последовательностей разбросаны по всей ДНК, однако есть и такие, которые объединены в группы (кластеры), или другими словами, расположены тандемно. Такие «тандемные повторы» называют сателлитной ДНК (впервые они были выделены в виде отдельной фракции ДНК после центрифугирования). Каждый кластер повторяющихся последовательностей принято называть сателлитом. Число повторов в сателлитах варьирует. В некоторых из них (их называют минисателлитами) последовательности повторяются лишь несколько раз. Между отдельными индивидуумами обнаруживается огромное разнообразие в числе повторов этих коротких последовательностей (они являются «гипервариабельными»). Поэтому минисателлиты иногда обозначают VNTR (variable number tandem repeats). Каждый индивидуум имеет в определенном локусе два аллельных минисателлита: один наследуется от матери и один от отца. Генетическая дактилоскопия представляет собой анализ длин минисателлитных последовательностей данного индивидуума.
Процедура
ДНК выделяют из клеток и обрабатывают рестриктазой. Для разделения полученных фрагментов используют электрофорез в агарозном геле; при этом фрагменты выстраиваются по размерам, как уже объяснялось в разд. 25.1 и показано на рис. 25.4. Дальнейшая процедура описана в разд. 25.7.9 и иллюстрируется рис. 25.34. Для переноса ДНК на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр используют Саузерн-блоттинг. Затем проводят гибридизацию ДНК с радиоактивным ДНК-зондом, который представляет собой последовательность, комплементарную повторяющейся минисатедлитной последовательности и идентифицируют связавшиеся с зондом фрагменты с помощью радиоавтографии.
Рис. 25.34. Генетическая дактилоскопия.
Как уже отмечалось, минисателлитные последовательности разных индивидуумов имеют различную длину. Зонд связывается с минисателлитами, которые у разных индивидуумов обнаруживаются в разных полосах на фильтре, поскольку их длины различны. Для каждого индивидуума рисунок (распределение минисателлитов) является характерным и поэтому называется дактилоскопическим отпечатком (рис. 25.34). Если зонд распознает и связывается с несколькими типами минисателлитов по всему геному, его называют мультилокусным зондом, и на радиоавтографе он будет давать множество полос. Чем больше полос, тем более уникален рисунок. Вероятность случайного совпадения четырех полос у двух людей составляет примерно 1 на 250, тогда как для 20 полос она меньше — 1 на 1012 (на Земле около 4,5 · 109 человек).
Мультилохусные зонды дают наилучший результат при использовании чистой, беспримесной ДНК. Однако судебные медики редко работают на свежем материале хорошего качества. Как правило, образцы чем-то загрязнены, например почвой или бактериями. Часто требуется более «мощный» метод. Этого достигают с помощью однолокусного зонда. Такой зонд можно использовать при работе с небольшими участками ДНК (например, с частично разрушенной ДНК), а также с малым количеством материала. Зонд распознает лишь одиночную короткую повторяющуюся последовательность, которая уникальна для одного миниеателлита и поэтому обнаруживается только на определенной паре гомологичных хромосом. При рестрикции образуются два характерных фрагмента для каждого индивидуума, и, следовательно, на радиоавтографе появятся две полосы, одна материнского и одна отцовского происхождения (рис. 25.35). Если используют два однолокусных зонда, то появится четыре полосы; если три, то — шесть, и т. д. Если требуется очень высокая достоверность в определении различий между двумя индивидуумами, то нужно использовать большое количество зондов (см. ниже). Этот метод называют генотипированием, а получаемый при этом профиль используют в судебной экспертизе чаше всего.
Метод можно сделать еще более чувствительным, если увеличить количество ДНК с помощью полимеразной ценной реакции (ПЦР). Это означает, что профиль ДНК можно получить, используя минимальную по объему пробу ДНК (например, выбитый с помощью дырокола кусочек облизанной подозреваемым почтовой марки). Любой человек, оставивший частичку перхоти или чихнувший на месте преступления, может стать подозреваемым!
Рис. 25.35. Наследование минисателлитов и разнообразие получаемых при этом профилей ДНК. Популяция в целом характеризуется огромным разнообразием длин минисателлитов, поэтому вероятность того, что у двух индивидуумов будут одинаковые профили ДНК, очень мала (см. текст).
Приложения
Ту же роль, что в начале 1900-х годов сыграла дактилоскопия, совершившая революционный переворот в судопроизводстве, в наше время играет метод генетической дактилоскопии. ДНК обычно выделяют из небольшого количества биологического материала, найденного на месте преступления, например пятен крови, волос или слюны. В случаях изнасилования используют сперму (рис. 25.36). Метод для определения отцовства стал рутинным. На рис. 25.37 приведен пример использования профилей ДНК при решении спорного вопроса об отцовстве.
Рис. 25.36. Генетическая дактилоскопия крови жертвы, спермы (образец) и крови подозреваемых.
Рис. 25.37. Профили ДНК людей, участвующих в споре об отцовстве (М — мать, Р— ребенок, О — отец).
25.8. Посмотрите на рис. 25.37. Кто из детей данной матери является сыном или дочерью предполагаемого отца?
Метод генетической дактилоскопии впервые был использован в судебной экспертизе в Великобритании в 1986 г. В 1983 г. в деревне недалеко от Лестера была найдена изнасилованная и убитая школьница; в 1986 г. был найден второй труп. Подозреваемый признался во втором преступлении, однако полиция предполагала, что он виновен и в преступлении 1983 г. Полиция попросила сотрудника Лестерского университета Джеффриза провести дактилоскопию ДНК из образцов спермы, взятых на местах двух преступлений и ДНК из пробы крови подозреваемого. Результаты анализа показали, что человек не был виновен ни в одном из преступлений! Исследовали всех местных мужчин (около 1500 человек), но снова не получили положительного ответа. В конце концов убийцу поймали в результате случайно подслушанного разговора в пивной. Дактилоскопический анализ ДНК подтвердил его виновность. Однако примерно в 30% случаев метод генетической дактилоскопии не дает соответствия тестируемой ДНК по профилю ДНК, обнаруживаемой на месте преступления.
Надежность и обоснованность
Под надежностью понимают возможность получения одного и того же результата при каждом повторном тестировании. Например, получат ли две разные лаборатории одинаковый результат при использовании одной и той же пробы? Для повышения надежности в Европе принимаются меры по стандартизации процедуры. Это важно при расследовании уголовных дел международного плана, таких как терроризм и наркобизнес.
Под обоснованностью подразумевают, что данный тест соответствует всем предъявленным требованиям. В судопроизводстве самое большое беспокойство вызывает тот факт, что два индивидуума могут иметь один и тот же профиль пли дактилоскопический отпечаток ДНК. Судебные разбирательства по этому поводу стали в ряде случаев главным содержанием последних известий. Джеффриз рассчитал, что два человека будут иметь одну и ту же полосу при использовании мультилокусного зонда примерно в одном случае из четырех. Следовательно, вероятность составляет один шанс из 4n, где n — число полос. Так, есть 1 шанс из 256, что у двух человек будут 4 одинаковых полосы, и менее чем 1 шанс из 1012, что они имеют 20—30 одинаковых полос (число полос в обычном дактилоскопическом отпечатке ДНК). Однако следует иметь в виду, что судебные эксперты часто вынуждены работать с материалом плохого качества, с деградированной ДНК, что не позволяет получить определенный ответ. Другая сложность заключается в том, что вероятность совпадения рассчитывается только для популяции в целом. Среди родственников будет обнаруживаться большее сходство.
Гораздо труднее сделать статистические расчеты для однолокусных зондов, поскольку каждая из полос встречается в популяции с разной частотой. В среднем, при использовании одного такого зонда полосы будут совпадать максимум в 1 случае из 100, при использовании двух зондов — в 1 случае из 10 000, а при использовании трех зондов — в 1 случае из 1 000 000. Между этническими группами существуют вариации, поэтому для разных групп населения должны использоваться различные базы данных.
Приведем несколько примеров использования ДНК-профилей:
1) для установления отцовства;
2) для подтверждения чистоты породы у животных;
3) для контроля генетического разнообразия при разведении редких видов животных;
4) в гражданских спорах о наследстве;
5) в судебной экспертизе для идентификации личности преступника.