БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006
Частина ІІ. Спеціальні біотехнології
Розділ 19.БІОТЕХНОЛОГІЇ ОДЕРЖАННЯ L-АМІНОКИСЛОТ
19.4.БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ L-ЛІЗИНУ
За вмістом лізину визначається біологічна цінність білка. Він сприяє секреції харчотравних ферментів і транспорту кальцію у клітини, покращує загальний азотний баланс в організмі.
Хімічний метод. Незамінну амінокислоту L-лізин можна одержувати шляхом хімічного синтезу із циклогексанону з подальшим розділенням рацемічної суміші і виділенням L-форми. Розділення рацемічної суміші із D- і L-форм лізину грунтується на різній розчинності солей, одержаних при взаємодії рацемату з L-винною кислотою. Сіль D-лізину і винної кислоти найменш розчинна. Після розділення D- і L-ізомерів лізину солі руйнують, L-форму звільняють від L-винної кислоти за допомогою іонного обміну на колонках, а D-лізин через стадію утворення аддукту з саліциловим альдегідом направляють на рацемізацію.
Комбінований або хіміко-ензиматичний метод запропонований у 70-і роки минулого століття японською фірмою «Тойо Рейон» («Торей»). Технологія включає в себе органічний синтез D, L-α-аміно-ε-капролактама із циклогексанона і подальший його ферментативний гідроліз. Процес відбувається за участю двох ферментів - L-гідролази і D-рацемази. Перший селективно гідролізує D, L-α-аміно-ε-капролактам з утворенням L-лізину і D-α-аміно-ε-капролактаму. Останній в результаті впливу другого ферменту - рацемази (D-а-аміно-ε- капролактам-рацемази) піддається рацемізації і знову вводиться в реакцію:
Продуцентами гідролази L-α-аміно-ε-капролактаму є штами дріжджів роду Criptococcus, Candidia, Trichosporon, а активаторами ерменту є двовалентні іони марганцю і цинку. Фермент рацемазу D-α-аміно-ε-капролактаму можна одержати при культивуванні бактерій родів Achromobacter, Flavobacterium та ін.
Обидва ферменти, які використовуються в технології, іммобілізовані методом адсорбції на іонообмінному цукрі.
Мікробіологічний метод. В усьому світі при отриманні кормового лізину перевагу надають мікробіологічному методу. Перше підприємство з виробництва лізину за допомогою мікроорганізмів було створене у Японії в середині 50-х років минулого сторіччя. В подальшому аналогічне виробництво налагоджено в Голландії і США. У Франції була створена велика промислова фірма з виробництва цієї амінокислоти — «Євролізин».
L-лізин синтезується мікроорганізмами двома принципово різними шляхами.
Мікроводорості, гриби, дріжджі синтез лізину здійснюють із α-кетоглутарової кислоти через α-аміноадипінову кислоту - аміноадіпінатний (АА) шлях. Регуляція активності ферментів цього шляху досліджена недостатньо, тому мутантів, здатних до надсинтезу лізину, серед цих мікроорганізмів не одержано.
Для бактеріальних культур, вищих рослин, деяких водоростей характерний інший шлях біосинтезу лізину - через α-діамінопімелінову кислоту — діамінопімеліновий (ДАП) шлях, який починається з аспарагінової кислоти. Крім лізину, із аспартату утворюються також інші незамінні амінокислоти - метіонін, треонін і ізолейцин (рис. 19.1). Продуценти лізину - глутаматпродукуючі коринебактерії Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, мають мутантні форми, які здійснюють надсинтез L-лізину.
Ще в 50-і роки минулого сторіччя японські вчені в результаті впливу мутагеном (ультрафіолетовим промінням) на суспензію бактеріальних клітин Micrococcus glutamicus одержали надпродуценти лізину. В колишньому Радянському Союзі надпродуценти лізину були одержані в 1964 р.
У промисловому виробництві лізину методом мікробного синтезу, де як продуцент використовується Corynebacterium glutamicum, відбувається інгібування продуктами реакції — лізином і треоніном, які, накопичуючись одночасно, за принципом зворотного зв’язку пригнічують активність аспартаткінази, що каталізує перетворення аспарагінової кислоти в семіальдегід аспарагінової кислоти, а отже, інгібує подальші етапи біосинтезу лізину. Для зняття обумовленої регуляторними механізмами заборони на надсинтез лізину був одержаний ауксотрофний штам (мутант), у якого відсутній фермент гомосериндегідрогеназа, що каталізує утворення із семиальдегіда аспарагінової кислоти гомосеріну, який інгібував біосинтез треоніну. Для росту мутанта (ауксотрофного штаму) необхідно екзогенне надходження у поживне середовище треоніну. Повільне введення в середовище екзогенного треоніну попереджувало включення механізму інгібування аспартаткінази продуктами реакції і біосинтез лізину у цього мутанта відбувався з максимальною швидкістю. Щоб примусити продуцент виробляти лізин і метіонін одночасно, ушкоджують механізм, який здійснює інгібування аспартаткінази продуктами реакції. Мутація гена, який кодує синтез аспартаткінази, приводить до його функціонування навіть при надлишковій кількості лізину у середовищі. У цьому випадку відбувається максимальне накопичення треоніну і лізину.
Рис. 19.1. Схема біосинтезу лізину
(за Івлей Д., 1984)
Виробництво лізину включає чотири головних етапи:
- підготовка поживних субстратів і їх стерилізація;
- вирощування посівного матеріалу;
- головна ферментація;
- зневоднення продуктів ферментації шляхом вакуумного випарювання з подальшим висушуванням упареного розчину у розпорошувальній сушарці або видалення кристалічного лізину.
Основною сировиною для виробництва кормового лізину є патока і кукурудзяний екстракт. Культивування продуцентів і біосинтез лізину проводиться у промислових біореакторах (ферментерах) об’ємом 50, 63 і 100 м3. Після закінчення ферментації готова культуральна рідина містить, крім лізину й інших продуктів метаболізму, біомасу продуцента і залишки поживного середовища. Вміст сухої речовини у ній становить 10-13 %, в т. ч. лізину 2-3 % і 0,8-1,8 % бактеріальної біомаси.
Залежно від конкретної мети виробництва на основі культуральної рідини можна одержати такі препаративні форми лізину: рідкий концентрат лізину (РКЛ), сухий кормовий концентрат лізину (ККЛ), а також висококонцентровані кормові і високоочищені кристалічні препарати для харчової і медичної промисловості.
Рідкий концентрат лізину отримують шляхом стабілізації культуральної рідини без відокремлення біомаси продуцента з подальшим вакуум-випарюванням до 35-40 % сухих речовин. Вміст лізину в ньому складає 7-12 %.
Сухий кормовий концентрат лізину одержують шляхом зневоднення рідкого концентрату. Він містить лізину від 10 до 20 %, залежно від використання наповнювачів.
Кристалічні препарати лізину одержують з культуральної рідини після відокремлення бактеріальної біомаси з вмістом 97-98 % L-лізину.
Такі товарні форми, як РКЛ і ККЛ містять, окрім лізину, і інші біологічно активні речовини - вітаміни В1, В2, В3, В4, РР тощо, які підвищують цінність кормових добавок.