БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

Розділ 20. БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ ФЕРМЕНТІВ

20.3.ОДЕРЖАННЯ ТОВАРНИХ ФОРМ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

20.3.1.Виділення ферментів

Наступною стадією біотехнологічного процесу одержання ферментних препаратів є виділення цільового продукту (ферменту). Ця стадія залежить від того, чи накопичується продукт у клітині (внутрішньоклітинні ферменти) або він виділяється у культуральну рідину (позаклітинні ферменти), чи продуктом є сама клітинна маса (рис. 20.1). Найскладніше виділити фермент (продукт), який накопичується в клітинах. Для цього клітини необхідно відокремити від культуральної рідини і зруйнувати (дезінтегрувати) клітинні оболонки.

Рис. 20.1. Основні етапи відокремлення і очищення біотехнологічних продуктів

(за Єгоровим Н.С. та ін., 1987)

Культура мікроорганізмів, вирощена поверхневим методом, і культуральна рідина після глибинного культивування містять велику кількість баластних речовин: біомасу продуцента, невикористані компоненти поживного середовища, продукти метаболізму. Частка ферментів становить майже 1 % для поверхневих і не більше 0,1 % — для глибинних культур.

Часто для подальшого використання ферментів їх потрібно виділити й очистити. Ці процеси трудомісткі і коштують дорого.

Виділення ферментів - це комплекс прийомів, які дають змогу отримувати ферментні препарати, придатні для використання у наукових дослідженнях, медицині і в біотехнології.

Виділення позаклітинних ферментів. Позаклітинні ферменти одержують із культуральної рідини після сепарації, тобто після розділення культуральної рідини і біомаси мікробних білків. Інколи сепарації передує спеціальна обробка культури - зміна рН, нагрівання, додавання коагулянтів білків для більш ефективного відокремлення біомаси і стабілізації продуктів. Є різні методи сепарації.

1. Флотація. Метод може бути використаним, якщо клітини продуцента в біореакторі накопичуються у поверхневих шарах рідини. Флотатори різних конструкцій зціджують, відкачують або зскрібають піну, яка містить мікробні клітини.

2. Фільтрація. Усі існуючі типи фільтрів (барабанні, дискові, стрічкові тощо) використовують один і той самий принцип - затримання біомаси на пористій фільтруючій поверхні.

3. Центрифугування. Метод ґрунтується на осаджуванні частин, які знаходяться у завислому стані в рідині з використанням центробіжної сили. Центрифугування вимагає більш дорогого обладнання, ніж фільтрування.

У деяких виробничих процесах центрифугування і фільтрація використовуються комбіновано - у фільтраційних центрифугах.

Виділення внутрішньоклітинних ферментів. Внутрішньоклітинні ферменти виділяють після руйнування (дезінтеграції) клітин.

Методи руйнування клітин. Для руйнування клітин застосовуються різні методи: механічні, фізичні, хімічні, біологічні й ензиматичні. Іноді для досягнення дезінтеграційного ефекту вдаються до сильних і надсильних впливів. Іноді застосування одного методу не дає бажаного результату. У такому разі клітини мікробів обробляють комплексно.

Механічні методи - це балистичний, екструзивний і декомпресійний.

Фізичні методи - осмотичний шок, термошок, плазмоліз, заморожування-відтаювання, висушування клітин, ультразвук, іонізуюча радіація.

Хімічні методи - дія кислот, лугів, солей органічних розчинників, поверхнево-активних речовин.

Ензиматичні методи - дія лізоциму та інших літичних ферментів.

Біологічні - інгібування біосинтезу клітинної оболонки, дія фагів, одержання мутантних форм мікроорганізмів-продуцентів ферментів із легкоруйнівними стінками.

Фізичні способи дезінтеграції більш економічні, ніж хімічні і біолого-ферментативні, бо не використовуються дорогі реактиви і ферментні препарати. Але вони можуть негативно впливати на якість продукту.

Перспективним для дезінтеграції мікроорганізмів-продуцентів вважається використання іммобілізованих ферментів.

Наступним за дезінтеграцією є етап відокремлення фрагментів клітинних стінок. Використовуються для цього ті самі методи, що й при сепарації клітин - фільтрація і центрифугування.