БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина І. Загальна біотехнологія

РОЗДІЛ 4. КЛІТИННА ІНЖЕНЕРІЯ

4.1.КУЛЬТУРА ЕУКАРІОТИЧНИХ КЛІТИН

Досягнуті молекулярною біологією і генетичною інженерією успіхи останнім часом значною мірою стали можливими завдяки застосуванню порівняно простих (а тому доступних широкому колу експериментаторів), відтворених і результативних методів, де як об’єкти дослідження широко використовуються бактерії, нижчі гриби і бактеріофаги. При цьому мікробні клітини і фаги розмножуються in vitro на агаровому середовищі, утворюючи відповідно колонії і бляшки, які являють собою потомство однієї особи (мікробної клітини чи вірусної частки). Розробка методів, що дозволяють одержувати і надалі підтримувати культури клітин еукаріотичних багатоклітинних організмів, у яких одноклітинний організм цілком зберігає геном вихідного виду й одночасно в багатьох відносинах поводить себе як мікроорганізм, є свого роду фундаментом, на якому зводиться будова клітинної інженерії і біотехнології.

Однією з основних властивостей клітинних культур є обмежена тривалість життя навіть за умови постійного перенесення їх на свіже поживне середовище (після 50-100 поділів клітинні культури гинуть). Не є винятком і такі клітини, які добре переносять культивування — фібробласти. Чим менше вік джерела, з якого отримані клітини для культивування в культурі, тим більше разів вони здатні ділитися перш ніж загинути. Так, якщо донором є плід, то кількість поділів клітин, що знаходяться у культурі, досягає 50; однак тільки до 30 разів діляться клітини, взяті для культивування у немовляти.

Для пояснення старіння і загибелі клітин запропоновано кілька гіпотез, одна з яких пов’язує старіння з нагромадженням соматичних мутацій, порушенням транскрипції і трансляції, біосинтезом значної кількості неактивних чи частково активних

молекул, що призводить до збільшення кількості аномальних продуктів обміну. Однак наводяться дані про те, що віруси в старій і молодій клітинній культурах розмножуються однаково успішно. У зв’язку з цим висловлюється думка про те, що апарат біосинтезу білка клітини-хазяїна, що бере участь у процесі репродукції вірусів, функціонує в старих культурах клітин так само добре, як і в молодих.

Гіпотеза запрограмованої загибелі клітин передбачає, що смерть клітин — це результат реалізації генетичної програми. Наявні експериментальні дані підтверджують, що загибель клітин у культурі й організмі настає після кількості поділів, які збігаються, і є наслідком реалізації генетичної програми. Висловлюється думка, що однією з причин загибелі клітин, у яких порушене співвідношення між швидкістю поділу й інтенсивністю обміну, є нагромадження ліпофусцину, що утворюється внаслідок розпаду білкових структур, ліпідів і гему. У клітинах, що діляться, накопичується ліпофусцин, який розподіляється між дочірніми клітинами. Крім того, речовини, що входять до складу ліпофусцинових гранул, використовуються повторно (Зенгбуш П., 1984). Процесу нагромадження ліпофусцину в загибелі клітин відведена важлива роль, але нема пояснення, чому настільки тривале життя в культурі ракових клітин. Анеуплоїдні (клітини, у яких число хромосом у ядрах не є кратним гаплоїдному набору), а також багато ліній пухлинних клітин є винятком з цього правила.

З 1951 р. культивується лінія анеуплоїдних (60-70 хромосом) пухлинних клітин, відомих як клітини HeLa. Вони були отримані з пухлинної тканини померлої від раку матки негритянки. На сьогодні ця культура клітин в умовах лабораторій за показниками росту перевершує інші лінії, отримані згодом від хворих на рак людей білої раси. Фермент глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа негрів і людей з білою шкірою при гель-електрофорезі поводиться неоднаково, що покладено в основу маркірування клітин HeLa. Що стосується рослинних клітин, то наявні дані до розмноження черешками свідчать про необмежену здатність клітин рослин до поділу.

Для підтримки функціонально активного стану клітин у культурі важливою була розробка відтворених умов культивування, особливо необхідність стандартизації складу поживного середовища. Так, у середовище для культивування фібробластів миші вводили кінську сироватку, екстракт із курячих ембріонів і солі. Ігол М.Г. (1955) запропонував багатокомпонентну суміш, відому як середовище Ігла (табл. 4.1).

Таблиця 4.1.

Склад середовища Ігла

Відомі модифікації цього поживного середовища, а також прописи середовищ, запропоновані іншими авторами. Якщо вимоги до складу поживного середовища з боку клітин не дуже суворі, то допустимі коливання реакції середовища невеликі (оптимум рН знаходиться у межах 7,2-7,4); зменшення чи збільшення рН на 0,2-0,4 супроводжується загибеллю клітин у культурі. При тривалому культивуванні зростають вимоги до буферних розчинів. Перевага надається гліцилгліциновому, трис-(гідроксиметил)-амінометановому і 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазинетансульфокислотному (ГЕПЕС) буферам. Вплив сироваткового компонента середовища Ігла на функціональний стан клітин у культурі тим ефективніший, чим менше вік тварини, від якої ця сироватка отримана (краще використовувати сироватку ембріонів).

Для забезпечення стерильності, що є наджорстко контрольованою умовою, останнім часом практикується використання стерильного пластмасового посуду (флаконів, чашок, піпеток) одноразового використання. У зв’язку з тим, що поділ деяких типів клітин у культурі настає лише тоді, коли вони прикріплені до субстрату, матеріал варто піддавати спеціальній обробці при підготовці до процедури культивування.

Зростаючі в культурі і прикріплені до субстрату клітини найчастіше сплющені і мають витягнуту веретеноподібну форму; клітини, що ростуть у суспензії, мають, як правило, сферичну форму.

Клітинну масу для культивування одержують шляхом триптичної обробки відповідного органу; останній розпадається на окремі клітини, що з дотриманням усіх обмежень, викликаних необхідністю дотримання стерильності, переносять на поживне середовище для культивування. Поодинокі еукаріотичні клітини, які не здатні ділитися, швидко гинуть. Враховуючи таку властивість при культивуванні вдаються до створення шару живильних клітин, для чого призначені для клонування клітини наносять на шар клітин, що втратили після опромінення здатність ділитися, але ще на певний час зберегли метаболізм. Цього виявляється достатньо, щоб нанесені на цей шар клітини почали ділитися. Однак кількість клітин, що вступили у фазу поділу, віднесена до кількості нанесених на живильне середовище завжди менша 100 %. При додаванні до живильного середовища деяких речовин-мітогенів здатність клітин до поділу підвищується.

Серед мітогенів розрізняють групу речовин (фактори росту), що містяться у сироватці крові в незначних кількостях, які мають властивості гормонів. Ідентифіковані фактори росту нервів (ФРН), епідермісу (ФРЕ), фібробластів (ФРФ) є білковими речовинами, молекулярна маса яких коливається від 6045 (ФРЕ) і 13,4 тис. (ФРФ) до 130 тис. (ФРН). Спектр їх дії набагато ширший, ніж стимулювання мітозу.

Крім факторів росту, мітогенною дією володіють речовини, названі лектинами. їхньою загальною властивістю є здатність специфічно зв’язувати залишки цукрів. Залежно від кількості ділянок, з якими вступають у взаємодію цукри, розрізняють дво- і полівалентні лектини. Основним джерелом лектинів є бобові (1,5-3 % усіх білків), хоча з бактерій, безхребетних (равлик) і хребетних (електричний вугор) також виділені ці речовини. З насіння рицини отриманий рицин, з конвалії мечоподібної — конканавалін А (Con A), з насіння квасолі — фітогемаглютинін (ФГА). При насиченні моноцукрами середовища, що містить лектини, останні втрачають здатність взаємодіяти з вуглеводовмісними рецепторами поверхні, тому що специфічні ділянки лектинів, з якими могли б вступити в реакцію вуглеводні рецептори клітинної стінки, займають раніше додані моноцукри. Клітини в культурі ведуть себе по-різному. Одні (фібробласти) легко піддаються культивуванню, інші (клітини епітелію, нейрони) поділяються значно важче.

Визначальним параметром поводження клітин у культурі є так зване контактне гальмування, чи регуляція клітинного росту, що залежить від кількості клітин на одиниці площі. Максимальна щільність, що може бути доступна для нормальних клітин у культурі, досягає 10⁴/см² особин; кількість ракових клітин на два порядки вища (10⁶/см²). Крім того, нормальні клітини, що ростуть на субстраті, являють собою моношарове утворення: ріст клітин пухлини характеризується безладністю, у зв’язку з чим виникає багатошарове утворення. Висловлюється думка, що причиною гальмування клітинного поділу є вилуження мікросередовища. Мітогени (речовини, що стимулюють клітинний поділ) і халони (речовини, що гальмують процес поділу) також виступають як регулятори клітинного росту. Такі властивості клітин, як адгезія (зчеплення клітин між собою і субстратом) і контактне гальмування, значною мірою залежать від характеру розподілу на клітинній поверхні і рухливості в мембрані вуглеводовмісних рецепторних молекул. За допомогою лек- тинів, що сприяють аглютинації клітин, установлено, що рецептори на поверхні пухлинних клітин розподілені нерівномірно (вони утворюють скупчення). Розподіл рецепторів на клітинній поверхні, їх кількісні і якісні характеристики значною мірою призводять до того, що адгезія і контактне гальмування в ракових клітинах проявляються слабше, а аглютинації під дією лектинів вони піддаються легше, ніж нормальні диференційовані клітини.