БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина І. Загальна біотехнологія

РОЗДІЛ 5. ОСНОВИ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

5.1.БІОТЕХНОЛОГІЯ КОНСТРУЮВАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

5.1.2.Плазміди і віруси як донорні переносники генетичної інформації

У молекулярній біології і генетичній інженерії як вектор (переносник) генів, що не мають аналогів у ДНК клітині-реципієнта, і тому не здатні брати участь у гомологічній рекомбінації, найчастіше використовують плазміди і фаг λ. Плазміди — це невеликі кільцеві молекули позахромосомної ДНК, що, на відміну від класичних генів, знаходяться в цитоплазмі бактеріальних клітин і клітин деяких дріжджів. У зв’язку з цим плазміди часто називають екстрахромосомними генетичними елементами. Автономне існування плазмід пов’язане з тим, що механізми, які лежать в основі їхньої реплікації, незалежні від механізмів, що регулюють розмноження бактеріальної хромосоми. Плазміди мають здатність вбудовуватися в геном клітини-хазяїна і знаходитися нескінченно довго в інтегрованому з ДНК бактерії стані. У цьому випадку генетичний матеріал плазміди поводиться подібно хромосомним генам бактерії, у які вона вмонтувалася. Відомі сьогодні плазміди розрізняються між собою розмірами, що є наслідком неоднакового обсягу генетичної інформації, що міститься у них; різними механізмами регуляції їхньої реплікації, що залежать від розходжень у ферментних системах, що забезпечують ці механізми. Залежно від молекулярної маси плазміди поділяються на дрібні (середня молекулярна маса 5x10⁶) і великі (приблизно встановлена гранична молекулярна маса 150-10⁶ — 170-10⁶).

До складу молекули плазмідної ДНК входить від 2250 до 400 тис. пар нуклеотидів. У клітинах бактерій кращою є конфігурація ДНК у вигляді дволанцюгових ковалентно закритих кільцевих надспіральних і дволанцюгових відкритих кільцевих молекул ДНК. Конфігурація дволанцюгової ковалентно закритої кільцевої структури, що при скручуванні перетворюється у надспіраль, характеризується високою стійкістю і зберігається в конформаційно зміненому стані навіть при впливі несприятливих факторів (наприклад, лужних розчинів). Плазміди в бактеріальних клітинах найчастіше знаходяться у вигляді ковалентно закритих кільцевих надспіральних структур і відкритих кільцевих молекул ДНК. Відкриті кільцеві молекули утворюються внаслідок розриву фосфодиефірних зв’язків в одному з ланцюгів. Вони не утворюють надспіральної структури, знаходяться в релаксованому (розслабленому) стані, менш стабільні при впливі несприятливих факторів, а в лужних розчинах дволанцюгова структура швидко деградує через розрив водневих зв’язків.

У бактеріальній клітині одночасно можуть знаходитися плазміди одного чи різних типів. Кількість копій дрібних плазмід буває, як правило, більше десяти; великі плазміди в більшості випадків представлені однією чи двома копіями з розрахунку на одну бактеріальну клітину. Визначено, що на долю плазмід припадає близько 1-10% клітинної ДНК. Так, якщо виходити з того, що в клітині Е.соlі міститься 10 дрібних плазмід, молекулярна маса кожної з яких 5·10⁶, а молекулярна маса хромосомної ДНК 2·10⁹, то в плазмідах виявляється зосереджено 2 % клітинної ДНК. Обсяг інформації, зосереджений у дрібних плазмідах, дозволяє їм кодувати молекули двох великих білків; у великих плазмідах можливості, що кодують, достатні для більш ніж 200 великих білків. Наявність деяких загальних ознак з помірними фагами дає підставу припускати існування однієї і тієї самої молекули ДНК у різних фазах — плазмідній і фаговій. Відомо, наприклад, що фаг λ найчастіше функціонує, убудовуючи свою молекулу ДНК у хромосомну ДНК бактеріальної клітини; фагова ДНК може також відтворюватися автономно, як розмножуються плазміди. Крім бактерій, дрібні кільцеві молекули ДНК (діаметр 1,1-2 мкм) зустрічаються в цитоплазмі клітин еукаріот (дріжджах, Neurospora, Euglena, трипаносомах, у клітинах тютюну, дрозофіли, шпорцевої жаби, а також у культурах клітин мишей, мавп, людини). На сьогодні вивчені фізико-хімічні властивості цих ДНК, однак їх походження і біологічна роль поки не визначені.

У 50-і роки ХХ ст. зусиллями Д. Ледерберга була виявлена екстрахромосомна генетична структура бактерій, що спочатку була відома як фактор фертильності, кон’югації, генетичного перенесення. Для позначення цієї структури був запропонований символ F. Клітини, що є носіями цього фактора, стали називати клітинами F+; у тих випадках, коли в клітині названий фактор був відсутній, її позначали F^-. Крім того, стало відомо, що при кон’югації бактерії двох штамів, клітини, що містять фактор

F, завжди виступають як донор генетичного матеріалу, клітини F^- — як реципієнт. Передача генетичного матеріалу від клітини- донора до клітини-реципієнта відбувається за рахунок кон’югації (аналог статевого процесу в бактерій), а структурою, що має властивості статевого фактора, виявився фактор F. Останній у зв’язку з його екстрахромосомною (цитоплазматичною) локалізацією, за пропозицією Ледерберга Д., стали називати плазмі- дою. У такий спосіб було встановлено, що плазміда F зумовлює тільки одну властивість бактерій, що є її носіями, — виступати як донор генетичного матеріалу. Виявлені іншими дослідниками позахромосомні фактори, подібні з F-плазмідами (плазміди Δ, T, FP, P), надають утримуючим їх клітинам здатність донорів генетичного матеріалу, а також мобілізують перенесення у клітини-реципієнти інших некон’югованих плазмід.

Плазміди детермінують стійкість бактеріальних клітин до одного чи одночасно до декількох ліків і останнім часом широко розповсюджені; їхніми носіями є майже усі види патогенних для людини і тварини бактерій.

Синтез коліцинів клітинами Е.соїі знаходиться під контролем плазмід Сої. Розрізняють кілька видів коліцинів А, В, С, D, Е та ін. Серед деяких з названих коліцинів, у свою чергу, виділяють такі варіанти як, наприклад, коліцин Е1, Е2, Е3. Тому в назвах відповідних плазмід, крім символу Сої, зазначаються назва синтезованого кишковою паличкою відповідного виду і варіанта коліцину — СоlЕІ, СоlЕ2 і т.д. Синтез подібних за біологічним значенням з коліцинами речовин (піоцинів) детермінується плазмідами, що містяться в псевдомонадах; стафілококові плазміди контролюють синтез стафілококцину, плазміди картопляної палички — мегацину і т.д. Загальною властивістю усіх бактеріоцинів є їх висока біологічна активність. Для гальмування життєдіяльності бактеріальної клітини достатньо декількох молекул бактеріоцину (висока ефективність поширюється лише на бактерії аналогічного чи близького виду). Коліциногенні (бактеріоциногенні) плазміди і детерміновані ними ефекти поширені серед бактерій, але не так часто, як R-плазміди.

Деякі плазміди (Ent, Hly, K88, K99) локалізуються тільки в клітинах ентеропатогенних штамів Е.соlі. Так, низькомолекулярний термостабільний і високомолекулярний термостабільний ентеротоксини синтезуються під контролем плазмід Ent. Залежно від того, чи одна з двох плазмід знаходиться у клітині чи їхній комплекс, клітини кишкової палички синтезують один із двох названих ентеротоксинів, або обидва види ентеротоксинів одночасно. Синтез а і β-гемолізинів (білкових речовин, що викликають гемоліз еритроцитів) ентеропатогенними клітинами кишкової палички детермінується плазмідами Hlyα і Hlyβ відповідно. Вони, як і плазміди Ent, можуть знаходитися у клітині як поодинці, так і обидві одночасно. У зв’язку з цим клітина синтезує один із двох названих ентеротоксинів, або обидва види одночасно. Спільне перебування у клітині плазмід К88 і К99, що контролюють синтез поверхневих антигенів 88 і 99, з плазмідами Ent підвищує патогенність таких клітин бактерій. У клітинах багатьох штамів Рsеudоmonas рutіdа локалізовані плазміди, кожна з яких детермінує біосинтез ферменту для утилізації якогось одного класу вуглеводнів. Так, плазміди SAL розщеплюють саліцилову кислоту, XYL — ксилол і толуол, NAN — нафталін, САМ — камфору, ОСТ — октан, гексан і декан. Усі названі плазміди вдається ідентифікувати за контрольованими ними ознаками, які виявляються фенотипічно. Плазміди, існування яких у клітинах бактерій фенотипічно не виявляється (а для їхньої ідентифікації необхідне застосування біохімічних методів), називаються критичними. Ці плазміди ще мало вивчені.

Перш ніж плазміди стали використовувати як незамінні об’єкти молекулярної біології і генетичної інженерії, були вивчені їхня загальна і спеціальна функції. У всіх видів плазмід виявлені такі загальні функції, як здатність реплікуватися (rер), несумісності (іnс), перенесення (tra — від англ. transfer — перенесення).

Плазміди — це молекули ДНК, тому за рахунок реплікації регулярно збільшується кількість плазмідних копій і вони рівномірно розподіляються між нащадками бактеріальної клітини, що ділиться. Найкраще вивчено механізм реплікації дрібної плазміди СоІЕ1, що представлена у клітині, як правило, великим числом копій (Зенгбуш П., 1982). У процесах ініціації й елонгації беруть участь продукти хромосомних генів, а для реплікації СоІЕ1 необхідні ДНК-полімераза III і ДНК-полімераза І. Останній фермент у реплікації хромосомної ДНК кишкової палички участі не бере, а використовується там у репараційних цілях. Висловлюється думка про те, що тільки початок реплікації плазміди СОІЕ1 детермінується її генним апаратом, інші функції, що забезпечують реплікацію плазміди, реалізуються за участю хромосомного апарату бактеріальної клітини. У деяких плазмід, що у клітині знаходяться в невеликій кількості (1-2 чи трохи більше копій на хромосому), існує власний, незалежний від хромосоми апарат, що забезпечує реплікацію. До таких плазмід насамперед належать фактори F, R1, рSCIO1 та інші.

Про реальне існування процесу реплікації плазмід свідчать непрямі дані, до яких насамперед варто віднести той факт, що кількість плазмід з розрахунку на хромосому бактеріальної клітини-хазяїна завжди є величиною постійною. З іншого боку, якщо припустити, що процес реплікації невластивий плазмідам, то при будь-якій первісній кількості плазмід у бактеріальній клітині, що ділиться, завжди має настати момент, коли ця бактеріальна клітина звільниться від плазмідних структур. Насправді такий феномен зникнення плазмід із плазмідвмісних клітин поки що ніким не був установлений. Є інші приклади, що підтверджують факт розмноження плазмід.

Молекулярний механізм розмноження плазмід дотепер цілком не вивчений. Наявні гіпотези, що допускають існування позитивного і негативного контролю розмноження плазмід, не в змозі пояснити існуючі факти. Так, наприклад, гіпотеза позитивного контролю базується на тому, що розмноження плазмід F і F' знаходиться під контролем власної генетичної системи, представленої тільки двома генами, один з яких здійснює контроль синтезу білкового продукту, що виступає як ініціатор процесу реплікації, а другий ген є оператором реплікації (реплікатором). Схема генетичного контролю розмноження плазмід F чи F' передбачає, що розмноження настає в той момент, коли немає обмежень для функціонування ініціатора (білкової субстанції) і реплікатора. Разом з тим установлено, що в процесі ініціації синтезу ДНК плазміди СоІЕІ реплікація не припиняється, незважаючи на присутність такого інгібітора білкового синтезу, як хлорамфенікол.

Точку зору про наявність у плазмід власної системи реплікації поділяють багато фахівців, однак функціональна активність цієї системи знаходиться залежно від рівня життєдіяльності бактеріальної клітини. Так, перебування бактеріальної культури в несприятливих для її розмноження умовах супроводжується збільшенням кількості плазмід у бактеріальній клітині. Крім того, на залежність розмноження плазмід від метаболічної активності бактерії вказує факт можливої участі РНК як запалу при реплікації плазмідної ДНК.

Пізнання механізму розмноження плазмід не є приватним питанням. Його значення в тому, що на прикладі реплікації плазмідної ДНК вивчаються фундаментальні механізми реплікації генетичного матеріалу взагалі, що має практичне застосування при розробці методів подолання лікарської стійкості бактерій, а також обмеження поширення бактерій, що є носіями R-плазмід.

Функція несумісності (inс) плазмід — це біологічне явище, що виявляється при забарвленні, і означає, що дві однакові плазміди не можуть стабільно існувати в одній клітині; потрапивши при схрещуванні з клітини-донора в клітину-реципієнт плазміда витісняє подібну плазміду («резидента»), або сама витісняється нею. Молекулярний механізм несумісності поки що нез’ясований.

Поряд з несумісністю при вивченні взаємодії бактерій було встановлене близьке до цього явище, що одержало назву поверхневого виключення. Схрещування клітин-донорів і клітин-реципієнтів, що є носіями подібних плазмід F, R чи Соl, незмінно супроводжується несприйняттям реципієнтною клітиною плазмідного матеріалу з клітини-донора. Хоча є досить переконливі дані, що вказують на існування плазмідного генного контролю поверхневого виключення, молекулярний механізм цього явища дотепер однозначно не встановлений. Що стосуться несумісності плазмід, то ні гіпотеза конкуренції плазмід за мембранний сайт (ділянка) реплікації, ні гіпотеза негативного контролю розмноження не можуть цілком пояснити молекулярний механізм цього явища. Однак немає також підстав заперечувати взаємозв’язок механізму несумісності і механізму розмноження, що контролює кількість плазмід в одній бактеріальній клітині. Відкрите явище несумісності плазмід покладено в основу їхньої класифікації. Висловлене припущення про філогенетичне споріднення плазмід, що належать до однієї групи, було підтверджено наступними дослідженнями. Установлено, що плазміди, які належать до однієї групи несумісності, характеризуються спільністю молекулярної будови їхньої ДНК; приналежність плазмід до однієї групи корелює з лікарською стійкістю бактерій. Класифікація плазмід за принципом несумісності дає можливість вивчити шляхи їхнього розповсюдження від одних бактерій до інших, а також шляхи поширення бактерій, що містять плазміди, у яких вони відіграють роль маркерів. Остання обставина дозволяє проводити плазмідний моніторинг. Усе це підвищує ефективність вивчення екології, епідеміології та епізоотології плазмід і бактерій, що утримують плазміди.

Функція перенесення (tra) є властивістю плазмід. Однак це властиве тільки великим плазмідам, з яких найбільш вивчена F Е.соlі. Молекулярна маса цієї плазміди досягає 65 млн, а кількість пар азотистих основ — 24 тис. Фактор перенесення (оперон перенесення, фактор F, плазміда F) містить 21 цистрон. Процес перенесення, що складається з декількох етапів, починається з того, що у певному місці плазміди, яке називається стартовою точкою перенесення (оriТ), відбувається розрив одного з ланцюгів ДНК. Потім цей ланцюг переноситься у клітину-акцептор. На одноланцюгових структурах ДНК, що залишилися в донорській клітині, а також на перенесених у клітину-акцептор, реплікуються комплементарні ланцюги.

Фактор F, як і інші плазміди, може включатися в бактеріальну хромосому за типом незаконної рекомбінації у визначених місцях. Незаконна рекомбінація — це процес, в основі якого лежить обмін негомологічними ділянками ДНК. Перебування фактора F в інтегрованому з хромосомою стані (стан Нfr), є однією з альтернативних форм існування плазміди, а хромосоми Е.соїі, у які включений фактор F, набувають здатності до перенесення в клітини придатного реципієнтного штаму, і цей процес при інтеграції плазміди F із хромосомою Е.соlі здійснюється з високою частотою. При впливі на бактеріальну клітину УФ-випроміненням частота включення плазміди F у хромосому цієї клітини підвищується.

З відомих спеціальних функцій, що кодуються окремими плазмідами, варто назвати плідність (здатність плазмід переносити генетичний матеріал шляхом кон’югації), стійкість до одного чи кількох антибіотиків (фактори R₁ плазміди R), важких металів (Cd²⁺, Hg²⁺), ультрафіолетового випромінювання, здатність до утворення бактеріоцинів (речовин, при дії яких на клітини настає їх загибель) і антибіотиків (метиленоміцину, актинородіну та ін.), токсинів і поверхневих антигенів (ентеротоксинів гемолізину, антигену К88 та ін.), індукцію пухлин у рослин (плазміда Ті з Аgrоbасtеrіum tumefaciens викликає утворення корончатого гала), метаболізм незвичайних джерел вуглецю (багато штамів Pseudomonas putida містять плазміди, що кодують ферменти для утилізації вуглеводнів), участь у споруляції стрептоміцетів.

Носіями такої спеціальної функції, як стійкість до антибіотиків і деяких інших груп лікувальних препаратів, є фактори R чи плазміди R (від англ. resistance — стійкість). Механізм стійкості обумовлюється тим, що плазмідні гени кодують синтез спеціальних ферментів; останні інактивують антибіотики шляхом їхнього розщеплення або шляхом модифікації ацетилюванням, аденіліруванням, фосфорилюванням. Крім того, деякі антибіотики (тетрациклін) і сульфаніламіди не спричиняють властивого їм антибактеріального ефекту через детерміновані зміни в бактеріальній мембрані.

Гени r, що зумовлюють лікарську стійкість, можуть бути в плазмідних факторах R об’єднані. Тоді формується ознака множинної лікувальної стійкості. У результаті інтенсивної хіміотерапії проти бактеріальної дизентерії один зі штамів збудника цього захворювання Shigella dysenteriae стійкий одночасно до всіх чотирьох використаних у лікувальних цілях лікарських препаратів — хлорамфеніколу, стрептоміцину, тетрацикліну і сульфаніламідів. Явище множинної стійкості до ліків сьогодні широко розповсюджене в патогенних і непатогенних бактерій (Е.соlі, Salmonella). Японські дослідники установили, що 65 % штамів Shigella і 50 % штамів усіх інших кишкових бактерій, отриманих від хворих чи тих, що перехворіли на дизентерію, виявилися стійкими до застосованих в лікувальних цілях антибіотиків (стрептоміцину, хлорамфеніколу і тетрацикліну), а також

до сульфаламідів. У плазмідах, поряд з декількома генами г, що детермінують множинну лікарську стійкість, міститься також фактор перенесення цієї стійкості RTF. Гени фактора RTF мають багато схожого з генами загального фактора перенесення F Е.соlі і забезпечують кон’югацію і реплікацію. Плазміди R часто є носіями ділянки RTF. У такому випадку вони при спільному культивуванні можуть передаватися іншим видам бактерій, що свідчить про трансмісивне походження сутності ознаки множинної лікарської стійкості. Найчастіше ділянка RTF, що забезпечує кон’югацію бактерій і реплікацію ДНК, а також детермінанти г знаходяться в одній молекулі ДНК. Натомісь відомо чимало випадків (наприклад, у бактерій Salmonella і Proteus), коли ці функціональні утворення знаходяться в різних молекулах. У природних умовах бактеріальні популяції, що є носіями плазмід, у яких фактори RTF і детермінанти г зосереджені в одній молекулі ДНК плазміди, просторово роз’єднані від тих бактеріальних штамів, у яких RTF і г знаходяться в різних плазмі- дах. Якщо плазміди є носіями тільки одного гена г і в них відсутній набір генів, що забезпечують функцію RTF, вони характеризуються невеликим розміром, забезпечують стійкість тільки до якоїсь однієї лікарської речовини і наявний ген лікарської стійкості не може бути переданий кон’югативним шляхом. Так, плазміда RpSClOl завдовжки 8,2 kb (маленька плазміда) має стійкість тільки до однієї лікарської речовини (антибіотика тетрацикліну), але ця ознака стійкості не може бути переданою за допомогою кон’югації (відсутність ділянки RTF). У природних умовах ген г, що детермінує ознаку стійкості до однієї лікарської речовини, скажімо, антибіотика, має здатність до взаємодії з плазмідами, що кодують стійкість до іншого антибіотика чи сульфаніламідного препарату. Об’єднання гена (чи генів) стійкості г до лікарських речовин (зазвичай до хімічних сполук) із плазмідами, що є носіями генів ділянки RTF, в остаточному підсумку приводить до виникнення плазміди, у якій комбінація RTF-r сприяє її швидкому поширенню в бактеріальній популяції. Хоча існують відповідні механізми контролю (зокрема, репресія функціональної активності RTF-r) за рахунок мутантних форм, де цей контроль ослаблений або відсутній, перенесення генів г у природних популяціях досить широко розповсюджений. Наприклад, у США (штат Атланта) був зареєстрований стійкий до дії антибіотика пеніциліну штам Neisseriagonorrhoeae, що є збудником гонореї. Для лікування захворювання, викликаного пеніциліностійким штамом, дозу антибіотика довелося збільшити в 24 рази (з 200 тис. до 4,8 млн одиниць). Різке зниження активності пеніциліну зумовлюється появою гена r, що детермінував синтез пеніцилінази. Фермент розщеплював пеніцилін і тим самим інактивував його.

Факт мікробної стійкості до дії пеніциліну був встановлений у Haemophilus influenzae — збудника менінгіту. Відомі й інші приклади міграції генів лікарської резистентності. Так, було встановлено, що ген, який обумовлює стійкість бактерій до тетрацикліну, може переходити з плазміди R у фаг, що розмножується в клітинах Salmonella, а потім у хромосому Salmonella, із хромосоми — у фаг λ і далі в trp-оперон Е.соlі, а потім знову у фаг λ. Простежений також шлях міграції гена стійкості до хлорамфеніколу.

Встановлене японськими дослідниками під керівництвом Митсухаши С. явище хромосомної міграції генів стійкості до деяких хімічних речовин було підтверджено в лабораторіях інших країн світу. Здатні до міграції генетичні елементи прокаріот, що кодують стійкість до певних хімічних сполук, були названі транспозонами, а для їхнього позначення стали використовувати символ Тn. З відомих нині транспозонів найбільш вивчені виділені з різних плазмід Tn1, Тn2, Тn3, що зумовлюють стійкість до ампіциліну; Тn4 зумовлює стійкість відразу до декількох хімічних сполук — стрептоміцину, ампіциліну і сульфаніламідів, Тn5 і Тn6 — до антибіотика канаміцину, Тn7 — до триметопріму і стрептоміцину, Тn9 — до хлорамфеніколу, Тn10 — тетрацикліну. До складу транспозонів входить близько 2600-5200 пар нуклеотидів.

При з’ясуванні причин високої здатності транспозонів до міграції на їхніх кінцях були виявлені повторювані нуклеотидні послідовності. Крім того, ще раніше було відомо, що деякі плазміди R містять неодноразово повторювані нуклеотидні послідовності (інвертовані повтори), що містять 800-1400 пар нуклеотидів. Характерною рисою повторюваних послідовностей є їхня генетична інертність, тому що вони не кодують жодних властивостей. На сьогодні найбільш вивченими є п’ять відмінних один від одного послідовностей (IS1, IS2, IS3, IS4 і IS5), що називаються вставними, або інтронами (від англ. intervening sequence, послідовності, які переривають). Ці елементи виявлені в Е.соlі, Salmonellatyphimurium, Qtrobacter freundii, у деяких плазмідах (F, R) і помірних фагах (λ). Так, хромосома Е. соlі містить вісім копій IS1 і п’ять копій IS2 — елементів, що відрізняються від вірусів і плазмід тим, що автономно реплікуватися не можуть. Вони є найменшими рухливими генетичними елементами, які мають довжину близько 1 kb. Крім того, IS-послідовності, як уже було сказано, не несуть жодних генів. Однак назвати їх інертним генетичним матеріалом неможливо, тому що вони, представляючи новий вид послідовності, впливають на експресію сусідніх генів, можуть виконувати функцію нових промоторів, блокують транскрипцію дистальних генів транскрипційної одиниці, можуть індукувати делеції й інверсії, що призводять до хромосомних перебудов, мають здатність вбудовуватися і вилучатися з бактеріального геному в різних місцях незалежно від гена гесА.

Варто звернути увагу на ту обставину, що IS-послідовності не мають постійного місця: їх знаходять у різних ділянках молекул ДНК. Включені в ці полінуклеотидні послідовності транспозони переміщаються разом з останніми, а в основі механізму включення транспозонів лежить принцип незаконної рекомбінації, тому що специфічність інтеграції насамперед визначається не спарюванням основ, а ДНК-білковими взаємодіями. Як уже було сказано, IS-елементи мають здатність вбудовуватися в різні місця геному, однак у деякі з них включення відбувається частіше, ніж в інші.

Висловлюється думка, що висока точність, з якою здійснюється вбудовування і виключення нуклеотидних фрагментів, свідчить про участь у цих реакціях білків, які специфічно взаємодіють з кінцевими ділянками IS-елементів.

Визначення послідовності нуклеотидів кінцевих ділянок транспозонів показало їхню повторюваність. Так, кінці транспозону, що зумовлюють стійкість до ампіциліну (Tn3), є зверненими повторами, що включають 38 нуклеотидних пар. Однак між кінцевими нуклеотидами транспозону Тn3 і пов’язаними з ним ділянками реципієнтної ДНК гомології не було встановлено. Таким чином, можна сказати, що транспозон — це ділянка ДНК, що складається з одного чи декількох генів стійкості, до якого по обидва боки прилягають елементи IS. Вивчення транспозонів, механізму і шляхів їхньої міграції, а також установлення транспозонів еукаріот необхідне для вирішення як теоретичних, так і практичних питань.

Така спеціальна функція плазмід, як біосинтез бактеріоцинів, виявлена в багатьох видів бактерій. За своєю хімічною природою бактеріоцини є білковими речовинами, молекулярна маса яких коливається в межах 40-100 тис. На сьогодні найбільш вивчені бактеріоциногенні властивості плазмід у клітинах Е. соїі. Бактеріоцини, кодовані генами цих плазмід, називаються коліцинами, а плазміди, що кодують їх, позначаються як СоlЕІ, ColE2 і т.д. Дія коліцинів характеризується різними механізмами. Так, біологічна дія СоlЕІ реалізується за допомогою інгібування процесів окисного фосфорилювання. Крім того, ця плазміда використовується в генетичній інженерії як вектор. Бактеріоциногенний ефект СоlЕ2 досягається за рахунок розщеплення ДНК, а СоlЕЗ спричиняє деградуючу дію на 3'-кінець 16S-рРНК, у зв’язку з чим порушується біосинтез білка, тому що рРНК втрачає здатність до специфічної взаємодії з іРНК; в основі механізму дії СоlК знаходиться порушення функції мембран бактерій. Об’єктами, на які ефективно діють коліцини, є бактерії цього ж виду чи близькоспоріднених видів, наприклад Proteus і Shigella.

Токсиноутворююча функція бактерій, що зумовлює їхню патогенність, реалізується за рахунок кодованого плазмідами біосинтезу ентеротоксинів, гемолізинів і антигенів. Плазміди Е.соїі, що кодують синтез ентеротоксинів, являють собою фактор перенесення (RTF), інтегрований різними генами, що несуть інформацію для синтезу двох білкових факторів, один з яких (ST) є термостабільною, а інший (LT) — термолабільною речовиною. Вплив на організм термолабільних ентеротоксинів спричинює важчі наслідки, ніж ST-ентеротоксини. Токсини Е.соlі, що викликають гемолітичний ефект, як і ентеротоксини, кодуються плазмідними генами і знаходяться в плазмідах, що мають здатність до перенесення. Ідентифіковані γ-, β- і γ-гемолізини. Для одержання гемолізину, що має патогенну дію, необхідна участь декількох цистронів, два з яких забезпечують біосинтез функціонально активного гемолізину, третій — проходження синтезованого гемолізину через бактеріальну мембрану і вихід його в зовнішнє середовище. Є дані, що для прояву патогенних властивостей синтезованого гемолізину необхідна участь двох інших плазмід, що у диких штамах Е. coli знаходяться в одній бактеріальній клітині разом з гемолізиновим детермінантом. Цей та інший приклади свідчать, що кодованих плазмідами токсинів буває недостатньо для досягнення бактеріальною клітиною патогенної дії. Однак участь як плазмід, так і хромосом у процесі перетворення непатогенних бактерій у патогенні поки що не встановлена. Практично нічого невідомо і про механізм дії поверхневих антигенів (К88 і К99) та їхніх молекулярних властивостей, хоча плазміди, що кодують ці антигени, певною мірою вивчені.

Плазміди можуть прямо чи побічно впливати на біосинтез антибіотиків, що в основному синтезуються стрептоміцетами. Нещодавно було встановлено, що плазміди беруть участь у біосинтезі метиленоміцину, хлорамфеніколу, тетрацикліну, макроліту. Часто про антибіотикоутворювальну функцію роблять висновок з її порушення в зв’язку з елімінацією плазмід із клітин за допомогою бромистого етидію, акридину оранжевого й інших речовин, хоча механізм цієї реакції цілком не вивчений.

Дуже важливою з практичної точки зору обставиною є здатність деяких бактерій (багато штамів Pseudomonas putida) утилізувати різні класи вуглеводнів, а також те, що ця властивість детермінується плазмідами, які мають здатність до перенесення. Нині при схрещуванні отримані штами Pseudomonas putida, у яких локалізована плазміда, що кодує синтез ферментів для розщеплення ксилолу, толуолу (XYL), i плазміда NAH, що кодує синтез ферменту для розщеплення нафталіну. Важливим успіхом з теоретичної і практичної точок зору є введення в бактеріальну клітину, що містить XYL- і NAH-плазміди, створеної гібридної плазміди, яка включила в себе частинки несумісних плазмід ОСТ і САМ. В одній бактеріальній клітині плазміди ОСТ і САМ через принцип несумісності одночасно бути присутніми не можуть, тому наведені дані є прикладом подолання несумісності.

Бактерія, у якій одночасно знаходяться у функціонально активному стані ХYL- і NАН-плазміди, а також гібридна плазміда, що включила частини ОСТ- і САМ-плазмід завдяки своїй здатності розщеплювати більшу кількість класів вуглеводнів, ніж штами, що містять у клітині одну плазміду, характеризується високою енергією росту при використанні сирої нафти як поживного середовища. Цю «супербацилу» передбачається застосувати для ліквідації витоків нафти, а також для очищення трюмів танкерів.