БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006
Частина І. Загальна біотехнологія
РОЗДІЛ 6. ДНК-ТЕХНОЛОГІЇ
ДНК-технології — це один з розділів молекулярної генетики, методи якого базуються на здатності специфічних ферментів-рестриктаз розщеплювати молекули ДНК на окремі фрагменти, які використовуються для упроваджування у геноми плазмід бактерій, фагів з метою одержання гібридних форм, які складаються з власної ДНК і вбудованих фрагментів чужорідної ДНК. Основні методи ДНК-технологій: клонування ДНК, ідентифікація генів, секвенування та синтез олігонуклеотидів, спрямований мутагенез ДНК, експресія синтезованих фрагментів ДНК, технологія одержання рекомбінантної ДНК та введення її у клітини. ДНК-технології дозволяють розробляти науково обгрунтовані програми селекції, виявляти та оцінювати поліморфізм молекул ДНК, досліджувати структуру геному, генофондів, забезпечити створення банків генів. ДНК-технології використовуються для: контролю за якістю сільськогосподарської сировини і продуктів харчування, діагностики інфекційних хвороб, виявлення генетичних (спадкових) захворювань на ранніх стадіях розвитку, дослідження геному на виявлення продуктивних якостей і використання у селекції, створення генетичних паспортів видів сільськогосподарських тварин, порід, таксономічних груп тощо. Сучасні ДНК-технології застосовують для керування потоком генетичної інформації, збереження біорізноманіття, створення нових форм тварин для одержання «біореакторів» (продуцентів, необхідних для людини білків), спрямованого отримання бажаних генотипів (використання стовбурових ембріональних клітинних ліній, трансплантації ядер бластомерів та соматичних клітин у яйцеклітини) та ін. Розвитку ДНК-технологій сприяла їх здатність вирішувати різні проблеми біології, медицини, сільського господарства, екології тощо.
У сучасний період бурхливий розвиток ДНК-технологій відбувається завдяки розробці нових молекулярно-генетичних методів досліджень. Методи аналізу ДНК засновані на рестрикції, гібридизації та ампліфікації. Рестрикція (restriction — розщеплення) — це процес розщеплення чужорідної молекули ДНК під дією специфічних бактеріальних ферментів-рестриктаз у певних специфічних ділянках, що мають назву сайти (site — ділянка) рестрикції, довжиною від 4-7 до 8-12 пар нуклеотидів. За допомогою рестриктаз макромолекули ДНК розщеплюються на фрагменти від декількох сотень до декількох тисяч пар нуклеотидів. Гібридизація (hybridization) — це здатність комплементарних ланцюгів нуклеїнових кислот утворювати комплекси. Принцип комплементарності використовують для ідентифікації окремих фрагментів ДНК і цілих організмів. Ампліфікація (amplification) — це процес утворення додаткових копій ділянок хромосомної ДНК, які містять певні гени.
Молекулярна біологія базується на принципі генетичного детермінізму. Дослідження на молекулярному рівні структурної організації як генів, так і в цілому геному дозволяє вивчати механізми функціонування генів. Використання молекулярно- генетичних методів дозволило дослідити в першу чергу геном прокаріот. Для молекулярно-генетичного аналізу складного геному еукаріот були необхідні інформативні маркери. Спочатку використовувалися тест-системи для виявлення продуктів генів (білковий поліморфізм), потім на рівні генетичного матеріалу клітин (поліморфізм ДНК). Більш інформативним виявилося використання як маркерів поліморфних послідовностей нуклеотидів ДНК за поліморфізмом довжини рестриктних фрагментів (ПДРФ). Проблема пошуку маркерів на рівні молекул ДНК була практично вирішена, коли відкрили метод ампліфікації фрагментів ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яку називають «золотою кулею» діагностики, — один із сучасних високочутливих методів молекулярної біології, який базується на принципі виявлення і багаторазового копіювання (ампліфікації) індивідуальних фрагментів ДНК. Принцип методу ПЛР (Polymerase chain reaction (PCR)) розроблений Кері Мюллісом зі співробітниками (фірма «Cetus», США) у 1983 р., який за ці роботи у 1993 році одержав Нобелівську премію. Зараз ПЛР широко використовується як для наукових досліджень, так і для діагностики в закладах охорони здоров’я, структурах держсанепіднагляду (генотипування, діагностика генетичних та інфекційних захворювань), ветеринарно-санітарної експертизи (визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у складі кормів) та ін.
В основі методу ПЛР лежить природний процес — комплементарна добудова ДНК матриці, яке здійснюється за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Ця реакція має назву реплікації ДНК. Природна реплікація ДНК має декілька стадій:
1. Денатурація ДНК (розплетення подвійної спіралі, розходження ниток ДНК).
2. Утворення коротких дволанцюгових ділянок ДНК (затравок, необхідних для ініціації синтезу ДНК).
3. Синтез нового ланцюга ДНК (комплементарна добудова обох ниток).
Цей процес можна використовувати для одержання копій коротких ділянок ДНК, специфічних, наприклад, для конкретних мікроорганізмів, тобто здійснювати цілеспрямований пошук таких специфічних ділянок, що і є метою генодіагностики для виявлення у даному випадку збудників інфекційних захворювань.
Полімеразна ланцюгова реакція, або специфічна ампліфікація ДНК, дає змогу вибірково синтезувати in vitro невеликі ділянки ДНК, які мають розмір від декількох десятків до сотень пар олігонуклеотидів (від грец. Oligos — малий). Тобто ампліфікація — це процес утворення додаткових копій певної нуклеоти- дної послідовності ділянок хромосомної ДНК. Як матриця можуть використовуватися різні зразки ДНК, що містять послідовність, яку треба ампліфікувати (тиражувати). Таким чином, ПЛР — це багаторазове збільшення кількості копій (ампліфікація) специфічної ділянки ДНК, яке каталізується ферментом — ДНК-полімеразою.
Для проведення ампліфікації необхідні наступні компоненти:
ДНК-матриця (ДНК або її частина, яка містить досліджуваний специфічний фрагмент);
Праймери (від англ. Primer — початковий, основний) — синтетичні олігонуклеотиди (20-30 нуклеотидних пар), які комплементарні послідовностям ДНК у межах специфічного фрагмента. Вибір специфічного фрагмента та підбір праймерів відіграє важливу роль у специфічності проведення ампліфікації, що позначається на якості аналізу.
Суміш дезоксинуклеотидтрифосфатів (ДНТФ) (суміш чотирьох ДНТФ, які є матеріалом для синтезу нових комплементарних ланцюгів ДНК).
ДНК-полімераза. При проведенні ПЛР-аналізу використовують різні ферменти:
Taq-полімераза — термостабільна ДНК-полімераза, яка каталізує подовження ланцюгів праймерів шляхом послідовного приєднання нуклеотидних основ до зростаючого ланцюга ДНК, що синтезується.
Taq-полімераза виділена з термофільної бактерії Thermus aquaticus, яка живе в гарячих джерелах. Фермент стабільний при високих температурах і зберігає високу активність у процесі ампліфікації.
Tth-полімераза, яка виділена з термофільної бактерії Thermus thermophilis. Температурний і рН оптимуми відповідно дорівнюють 75 оС і 9,0. Фермент має ревертазну активність і використовується з РНК-матрицею у реакції синтезу комплементарної молекули ДНК. Для одержання специфічних ділянок геному РНК-вмісних вірусів спочатку отримують ДНК-копію з РНК-матриці шляхом використання реакції зворотної транскрипції (RT), яка каталізується ферментом — ревертазою (зворотною транскриптазою).
Pwo-полімераза, яку отримують з термофільної бактерії Py- rococcus woesei. Фермент більш термостабільний, ніж Taq- і Tth-полімерази.
Буферний розчин (реакційне середовище, яке містить іони Mg2+, необхідні для підтримки активності ферменту).
Необхідною умовою при ампліфікації є наявність «праймерів» — синтетичних невеличких фрагментів ДНК, які складають ся з 20-30 пар нуклеотидних основ. Праймери комплементарні ділянкам (сайтам) відпалу на ідентифікованій матричній ДНК.
ПЛР-аналіз відбувається циклами, кожний з яких складається з трьох послідовних стадій, які відбуваються при різних температурах:
1. Денатурація або процес плавлення молекул ДНК (to=93-95 oC). При цьому дволанцюгова форма перетворюється на одноланцюгову, яка стає доступною для праймерів.
2. Відпал — приєднання праймерів, один з яких комплементарний початку одного ланцюга ДНК, а другий — кінцю іншого.
3. Подовження (елонгація) ланцюга ДНК за рахунок приєднання дезоксинуклеотидтрифосфатів за принципом комплементарності. Відбувається за участю ДНК-полімерази термофільної бактерії Thermus aquaticus (Taq-полімерази) при температурі 60-70 оС. Утворюються дволанцюгові молекули ДНК — точні копії необхідного фрагмента.
Цей триступеневий цикл, у процесі якого утворюються синтезовані фрагменти ДНК-амплікони, повторюється 30-40 разів. З кожним циклом кількість сегментів ДНК, обмежених з обох кінців, що використовуються праймерами, збільшується експоненціально (C=2n, де n — кількість циклів). Вихід інших продуктів збільшується лінійно.
Полімеразна ланцюгова реакція проводиться в термоциклері (ампліфікаторі) — термостаті, в якому автоматично змінюється температурний режим. Наступний етап ПЛР — детекція або виявлення ампліфікованої ДНК. Ампліфіковані специфічні фрагменти ДНК виявляють методом горизонтального електрофорезу в агарозному гелі з барвником (бромистий етидій). Барвник утворює з фрагментами ДНК стійку сполуку, яка проявляється у вигляді смуг, що світяться при опроміненні гелю УФ-випромінюванням при довжині хвилі 290-330 нм. Продукт електрофорезу розглядають в УФ-світлі за допомогою спеціального приладу — трансілюмінатора і фотографують.
ПЛР може бути доповнена рестрикційним аналізом ампліфікованої ДНК, що потрібно для визначення поліморфізму ДНК.
Для лабораторії ПЛР необхідні три ізольовані кімнати з наявністю води і вентиляції. Для попередження контамінації або потрапляння будь-яким шляхом із зовнішнього середовища в реакційну суміш продуктів ампліфікації, що викликає хибнопозитивні результати, основними видами робіт є підготовка досліджуваних зразків, ампліфікація та детекція продуктів ПЛР, які потрібно ізолювати один від одного і проводити в різних приміщеннях. Робота організовується в одному напрямі: від ПЛР-приміщення до кімнати, де відбувається детекція продуктів полімеразної реакції.
При проведенні ПЛР необхідно одночасно проводити постановки контрольних проб — позитивної і негативної. В пробірку з позитивним контролем вносять препарат, в якому міститься визначена послідовність ДНК. У пробірці з негативним контролем замість досліджуваного зразка ДНК вносять аналогічний об’єм води. Використовують також так званий «внутрішній контроль», при якому в реакційну суміш додають зразок ДНК, який має специфічні сайти приєднання праймерів, але відрізняється за довжиною від очікуваного цільового фрагмента. Виявлення специфічних продуктів ампліфікації внутрішнього контролю — сигнал успішного проходження ПЛР. Якщо продукти ампліфікації внутрішнього контролю не виявляються — реакція за будь-яких причин не відбулася.
Сьогодні велика увага приділяється розробці ПЛР-тест-систем (діагностикумів), які необхідні для виявлення ДНК збудника різних інфекційних хвороб.
Одним з надто складних завдань ветеринарних лабораторій є визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у складі комбікормів. В останні роки ця проблема набула великого значення у зв’язку з відкриттям пріонних захворювань сільськогосподарських тварин, які належать до групи губчастоподібних енцефалопатій (ГЕ). З 1996 р. у всіх країнах Євросоюзу введена заборона на згодовування жуйним тваринам м’ясокісткового борошна, яке виготовлене з органів ссавців. Це пояснює важливість визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у складі комбікормів.
Значно складніше провести цю ідентифікацію у кормах, які піддавалися термічній обробці (м’ясокістковому та рибному борошні, сухих та консервованих кормах для домашніх тварин). При термічній обробці відбувається денатурація білків і втрата
видової специфічності, у зв’язку з чим імунодифузія в гелі, ізоелектричне фокусування, імуноферментний аналіз, які використовуються для ідентифікації сирого м’яса, в такому випадку непридатні. Є підстави сподіватися, що використання ПЛР-тест-систем, які мають високу чутливість і специфічність, дасть можливість вирішити цю проблему. Прикладом такої тест- системи є розроблена методика для визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у складі сумішей.
При розробці тест-системи для визначення видової належності м’ясних інгредієнтів у складі продуктів харчування та кормів використовували наступну схему. Шляхом аналізу нуклеотидних послідовностей були вибрані специфічні олігонуклеотидні праймери, які специфічні до ДНК мітохондріального геному жуйних. Для диференціювання виду жуйних праймери відібрані з урахуванням мультиплексної ПЛР, у якій утворюється два специфічних ПЛР-продукти різної довжини: перший для ДНК великої рогатої худоби — (680 п.н.), а другий — для ДНК дрібної рогатої худоби (350 п.н.). Після цього у препаратах ДНК, які виділені з крові ВРХ, овець, свиней, птиці та м’яса риби, визначається чутливість та специфічність вибраних праймерів. Проведені дослідження дозволили встановити, що коли ІФА дозволяє виявляти домішку м’ясокісткового борошна в рибному борошні тільки в концентрації не менше 50 %, то при проведенні ПЛР-аналізу чутливість зростає і дає можливість визначати вже 1 % домішку. Тобто при виявленні домішок тканин жуйних тварин у складі кормів чутливість ПЛР тест-системи була у 50 разів вищою, ніж при проведенні імуноферментного аналізу.
Використання тест-систем дозволяє запобігти фальсифікації рибного борошна тканинами ссавців, проводити диференціацію видової належності протеїнів у складі кормів для тварин і м’ясопродуктах. Це також має важливе епідеміологічне значення.
Зараз ПЛР — один з основних молекулярно-генетичних методів, які застосовуються в різних галузях:
- тваринництві — це дослідження геному сільськогосподарських тварин на наявність продуктивних якостей для вирішення проблем селекції; діагностика спадкових хвороб тварин; створення генетичних паспортів порід, видів; діагностика інфекційних захворювань та проведення епізоотологічного моніторингу;
- у ветеринарній медицині — це діагностика таких хвороб, як сальмонельоз, бруцельоз, лістеріоз, туберкульоз, чума ВРХ, класична чума свиней, хвороба Ауески, лейкоз, стафілококоз, мікоплазмоз, хвороба Марека, хвороба Гамборо, хвороба Ньюкасла, чума м’ясоїдних, вірусний ентерит, реовірусна інфекція, генетичні захворювання та ін;
- у харчовій промисловості — для визначення наявності різних патогенів у продуктах харчування.