БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

РОЗДІЛ 9. ВИКОРИСТАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ ФЕРМЕНТІВ У АНАЛІТИЧНІЙ РОБОТІ

9.3.ФЕРМЕНТНІ ЕЛЕКТРОДИ

Це тип ферментних реакторів, у яких фермент і електрод утворюють єдину конструкцію, яка не потребує для їхнього функціонування додаткових реагентів, окрім буферного розчину. Такі електроди одержали назву «безреагентних» датчиків, а методи аналізу, що ґрунтуються на їх використанні називаються «безреагентними». Електроди разом з іммобілізованими ферментами, утворюючи єдину конструкцію, являють собою ферментний електрод (рис. 9.2).

Рис. 9.2. Ферментні електроди (за Березіним та ін., 1987): а — ферментний електрод на основі скляного електрода для вимірювання рН: 1 — металевий електрод; 2 — гумове кільце; 3 — діалізна плівка або інша напівпроникна мембрана; 4 — розчин ферменту або шар полімерного гелю, що містить фермент; 5 — скляна мембрана, яка проникна для іонів водню; 6 — приелектродний буферний розчин; б — схема електрода для визначення глюкози: 1 — катод; 2 — електрод порівняння, який знаходиться у внутрішньому буферному розчині; 3 — напівпроникна полімерна мембрана; 4 — шар іммобілізованої глюкозооксидази; в — електрод для визначення сечовини; в цьому електроді уреаза іммобілізована в гелі, який нанесений на поверхню скляного електрода.

Єдина конструкція створюється шляхом розміщення розчинного або іммобілізованого на розчинному носії ферменту в приелектродному шарі, який відділений від решти простору діалізною мембраною. Однак частіше ферменти включають у полімерні або гелеві плівки альбуміну, желатину, колагену, агар-агару, гідроксиду алюмінію або ковалентно приєднують до напівпроникних целюлозних, полікарбонатних мембран чи до поверхні скляних дисків. Потім така плівка (або диск) прикріплюється до поверхні електрода.

У ферментних електродах, як і в інших ферментних аналітичних системах, можуть використовуватися не тільки одноферментні, але й поліферментні системи і навіть клітини мікроорганізмів. В останньому випадку одержують так звані «бактеріальні» електроди. Так, іммобілізовані нітрифікуючі бактерії окислюють аміак з утворенням нітриту киснем, зниження якого вимірюється електродом Кларка. Аналогічні методи були розроблені для визначення метану і інших газів, а також для етанолу, оцтової кислоти, мутагенів. Мікробні електроди прості, селективні, стабільні і можуть використовуватися для контролю забруднення довкілля.

Г. Рехніц у 1977 р. покрив NHg-чутливий електрод пастою клітин Streptococcus faecalis і за його допомогою визначав аргінін за реакцією дезамінування. Час роботи такого електрода складав 20 діб, а час відповіді - 20 хв. Якщо на електрод наносити попередньо зруйновані клітини, то час відповіді скорочується до 10 хв, а тривалість роботи електрода збільшується до 40 діб.

Потенціометричні ферментні електроди використовуються для визначення амінокислот, сечовини, нітрат- і нітритіонів, пеніциліну. З ферментів у них використовуються оксидази або декарбоксилази амінокислот, уреаза, нітрит- і нітратредуктаза та ін.

Важливим напрямом сучасного ферментативного аналізу є використання мультиферментних систем, у яких один з ферментів забезпечує специфічність реакції, а інший - переведення продуктів цієї реакції у речовину, яка легко детектується (виявляється) фізико-хімічними методами. Наприклад, деякі ферментативні реакції, пов’язані з утворенням перекису водню, можуть використовуватися для фотометричного аналізу разом з пероксидазою. Для визначення різних вуглеводів як універсальний детектор використовується глюкозооксидаза. Наприклад, визначення лактози здійснюються таким чином:

На основі електрода на глюкозооксидазу можуть бути створені електроди на різні вуглеводи (лактоза, цукроза, поліцукри).