БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

Розділ 12. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА ГОРМОНІВ

12.1 ШЛЯХИ ОТРИМАННЯ ГОРМОНІВ

Біотехнологія сприяє розвитку нових шляхів у медицині щодо одержання таких цінних біологічно активних речовин, як гормональні препарати. В організмі людини і тварини виробляються десятки різних сполук, які беруть участь в гормональній регуляції росту, розвитку й обміну речовин. Неабиякі зрушення відбулися в напрямі синтезу пептидних гормонів, побудованих із порівняно невеликої кількості ланок - від кількох амінокислотних залишків до декількох десятків. До них належать гіпоталамічні фактори, деякі гіпофізарні гормони, гормони щитовидної залози, гормони підшлункової залози і кишечника, нейропептиди. В ендокринних клітинах гормони даної групи утворюються зі значно більших попередників шляхом специфічного ферментативного розщеплення чітко визначених пептидних зв’язків.

Гормони росту і пролактин побудовані з більшої кількості амінокислотних залишків (приблизно 190-195) і утворюються в результаті відщеплення від їх попередників - прегормонів N-кінцевого пептиду, який називають «сигнальним», розміром близько 25 амінокислотних залишків.

Донедавна пептидні гормони, необхідні для медицини, виділяли в основному з органів і тканин тварини та людини (крові донорів, видалених при операціях органів, трупного матеріалу, органів після забою тварин тощо). Із органів тварин одержували гормони для застосування у випадках, коли гормон не має вираженої видової специфічності. Єдиним джерелом одержання гормонів з надто вираженою видовою специфічністю, наприклад соматотропіну людини (гормону росту), був трупний матеріал. Для одержання невеликої кількості гормонального препарату необхідно багато матеріалу (сировини).

Перші успіхи генетичної інженерії вселили надію на те, що з часом можна буде використовувати клітини мікроорганізмів для виробництва будь-яких продуктів білкової природи шляхом введення в їх геном генів, які кодують ці білки, і створення умов для їх експресії. Розробляючи нові технології виробництва гормонів з використанням плазмід, головною метою було створити (сконструювати) рекомбінантні молекули ДНК, які містять нуклеотидні послідовності, що програмують синтез певних гормонів, ввести їх у бактерію і змусити продукувати ці гормони.

Технологія одержання гормонів за допомогою рекомбінантних ДНК включає такі етапи: 1) одержання генетичного матеріалу (генів); 2) введення генетичного матеріалу в генетичний апарат бактеріальної клітини і створення умов для його експресії.

Одержання генів. Необхідний генетичний матеріал (ген або групу генів) для їх подальшого примноження методами генетичної інженерії з метою синтезу біологічно активних білків, що кодуються цими генами, можна досягнути трьома різними методами: 1) виділенням його з ДНК; 2) хіміко-ферментативним синтезом; 3) ферментативним або матричним синтезом на основі виділеної з клітини матричної РНК (мРНК).

Перший метод полягає в тому, що з природного генетичного матеріалу - ДНК - за допомогою відповідних ферментів (рестрикційних ендонуклеаз) «вирізають» потрібний ген. Цей підхід має суттєві недоліки. По-перше, важко підібрати дію ферментів таким чином, щоб вирізати з ДНК необхідний ген. Як правило, разом з геном залишаються «по боках» зайві нуклеотидні послідовності, що заважає наступному використанню одержаного гена, або, навпаки, ферменти відрізають частину гена, що робить його функціонально неповноцінним. По-друге, гени еукаріотичних організмів мають складну «мозаїчну» (екзонінтронну) будову, що в подальшому при розмноженні в мікроорганізмах може перешкоджати їх нормальному функціонуванню, тому що в бактеріях не відбувається видалення зайвих частин (інтронів). Тому цей прийом виділення генів краще спрацьовує стосовно вірусів і бактерій, але не еукаріот. По-третє, якщо ген становить незначну частку від цієї ДНК, з якої його виділяють, то можуть виникнути серйозні труднощі щодо його ізоляції та ідентифікації.

Другий метод полягає у хіміко-ферментативному синтезі гена, якщо відома первинна структура того білка або поліпептида, який кодується синтезованим геном. Він є важливою альтернативою «вирізанню» генів за допомогою рестриктаз із натив- ної ДНК. Метод включає хімічний синтез коротких (8-16 нуклеотидних) одноланцюгових фрагментів ДНК за рахунок поетапного утворення ефірних зв’язків між нуклеотидами і зшивання олігонуклеотидів між собою за допомогою ДНК-лігази з утворенням дволанцюгових полінуклеотидів.

Хіміко-ферментативний синтез дає змогу точно відтворити мінімально необхідну послідовність нуклеотидів і уникнути проблем, пов’язаних з елімінуванням зайвих нуклеотидних послідовностей у фрагментах ДНК, в т. ч. інтронів. Метод трудомісткий і дорогий. Методом хіміко-ферментативного синтезу одержані гени соматостатину, А- і В-ланцюгів інсуліну, проінсуліну, lac-оператор E.coli тощо.

Третій метод одержання генів матричним синтезом найбільш розповсюджений і є основним джерелом генів, які потім розмножуються у формі рекомбінантних ДНК в одноклітинних організмах, а інколи і в багатоклітинних. Суть методу полягає в одержанні генів шляхом їх ферментативного синтезу і коротко зводиться до наступного. Спочатку із клітин виділяють матричні (інформаційні) РНК (мРНК), серед яких присутня мРНК, що кодується геном, який потрібно виділити. Потім у спеціальних умовах здійснюють РНК-направляючий синтез ДНК (одноланцюгової), який каталізується ферментом зворотною тран- скриптазою (ревертазою). Після завершення реакції синтезовану одноланцюгову ДНК (яку називають комплементарною ДНК, кДНК) очищують і використовують як матрицю для другої реакції - ДНК залежного синтезу другої нитки ДНК. Це можливо завдяки відкриттю у 1970 році (США) ферменту зворотної транскриптази головною властивістю якої є здатність здійснювати синтез, зворотний тому, який проходить при транскрипції - синтез мРНК на матриці ДНК. Це стало науковою сенсацією і спростувало «центральну догму» молекулярної біології, яка стверджувала, що передача генетичної інформації триває тільки в одному напрямі: ДНК → РНК → білок.

Ступінь копіювання мРНК в ДНК, тобто повнота синтезу однієї з ниток гена, що синтезується, залежить від відсутності у препаратах мРНК і ферменту домішок, які могли б руйнувати мРНК або ДНК - продукт синтезу. Тому успішне проведення реакції синтезу залежить від ідеального очищення усіх компонентів.

Введення гена в бактеріальну клітину. В подальшому клонування генів відбувається за наступною схемою. Кільцеподібну молекулу вектора (частіше плазміду E. соїі) розрізають ферментами рестриктазами у специфічній ділянці в обох ланцюгах ДНК, перетворюючи його із кільцевої на лінійну форму. До лінійної ДНК за допомогою ферменту ДНК-лігази (ligation - зшивання) «пришивають» ген (або гени) і потім знову замикають її у кільце за допомогою тієї ж ДНК-лігази. Одержану рекомбінантну ДНК вводять у клітину E. соїі, котра розмножуючись, утворює клон, усі клітини якого містять рекомбінантну ДНК (плазміду), а тому і чужорідний ген. Останній, тепер клонований у клітинах кишкової палички, індукує в них біосинтез відповідного білка (продукту).