БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

Розділ 12. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА ГОРМОНІВ

12.2.ОТРИМАННЯ ІНСУЛІНУ

12.2.2.Нові технології одержання інсуліну

Невелику молекулу інсуліну можна синтезувати штучно, приєднуючи одну амінокислоту за іншою. Але це дуже дорогий і складний синтез, з майже 170 хімічними реакціями. Він був проведений у 1963 і 1965 роках у США, Китаї і ФРН.

Простіше одержувати інсулін людини шляхом модифікації інсуліну свині, хімічно замінивши в ньому 30-у амінокислоту (ланцюга В) аланін на треонін. Цей метод був розроблено у Данії компанією «Ново індастрі» у 1980 р. В результаті був отриманий однокомпонентний інсулін людини 99 % чистоти. Порівняльне дослідження обох інсулінів (людського і свиного) показали, що вони не відрізнялися між собою за активністю і тривалістю дії. І в 1982 р. цей інсулін промислово виробляли в основному дві компанії: «Елі Ліллі» (збут у США) і «Ново індастрі» (збут у Європі).

Роботи щодо генно-інженерного методу одержання інсуліну розпочалися нещодавно і розвивалися швидкими темпами. В 1978 р. у США з’явилося повідомлення про одержання штама E. соїі, який продукує щурячий інсулін. В тому ж таки 1978 р. компанія «Генентек» (США) одержала інсулін людини у спеціально сконструйованому штамі кишкової палички. Виробництво інсуліну в бактеріальних клітинах не залежить від постачання сировини, а одержаний інсулін при тривалому використанні не викликає негативних наслідків (порушення роботи нирок, розладів зору та алергічних реакцій).

Було випробувано декілька методів генетичної інженерії для одержання інсуліну. В деяких країнах (США) пішли шляхом синтезу ДНК (гена) на матриці іРНК інсуліну, тобто одержання копії ДНК (кДНК). В інших (Канада, СРСР) - шляхом

хімічного синтезу двох коротких ДНК (генів), які кодують обидва ланцюги (А і В) готового інсуліну, з подальшим синтезом кишковою паличкою (E. ooli) його А- і В-ланцюгів.

У 1980 р. в США з людських тканин була виділена мРНК інсуліну, з якої шляхом зворотної транскрипції була синтезована її ДНК - копія (кДНК) і в клітинах E. соїі був клонований ген людського проінсуліну. Поряд з цим у Канаді здійснено повний хіміко-ферментативний синтез гена проінсуліну.

У 1979 р. Креа, Крашевські, Хіроуз і Ітакура з Національного медичного центру «Хоуп» (Каліфорнія) і Геддель зі співробітниками компанії «Генентек» здійснили синтез генів, які кодують А- і В-ланцюги інсуліну. Кожен ген був зібраний відповідно із 18 і 11 олігонуклеотидів. Однак виявилося, що коли короткі ланцюжки чужорідного білка синтезуються в бактерії E. соїі, а отже, вони руйнуються її протеолітичними ферментами. Щоб уникнути цього, ДНК (ген), який кодує кожний ланцюг інсуліну, пришивали за допомогою лігази до гена бактеріального ферменту галактозідази, розділивши їх кодоном, який кодує метіонін. В результаті в бактерії синтезувався великий білок, який складався із бактеріального ферменту і гормону. Їх розділяли один від одного хімічно, розрізаючи білок по метіоніну, відщеплювали від ферменту, проводили очищення, а ланцюги з’єднували in vitro для одержання повної молекули інсуліну.

У Радянському Союзі в Інституті біоорганічної хімії ген проінсуліну був одержаний методом тотального хіміко-фермен- тативного синтезу (рис. 12.1). Цей підхід має певні переваги: по-перше, можна безпосередньо одержати необхідну послідовність ДНК; по-друге, хімічний синтез виключає найважчу частину роботи при одержанні гена із природного джерела - виділення відповідної мРНК або геномної ДНК; по-третє, він спрощує модифікацію гена і одержаного з нього білка. Цей метод одержання гена проінсуліну проходить у два етапи. На першому етапі відбувається хімічний синтез понаде 40 олігонуклеотидів - сегментів, з яких складається весь ген. На другому етапі проходить збір хімічно синтезованих сегментів за допомогою ДНК-лігази. Потім ген вводиться у плазміду кишкової палички, яка продукує проінсулін, що конверсується в активний інсулін.

Рис. 12.1. Схема отримання інсуліну людини мікробіологічним

шляхом

(за Єфімовим В.А., Чахмачовою О.Г., 1984)

Вихід інсуліну можна збільшити шляхом введення в одну бактеріальну клітину декількох копій рекомбінантної плазміди. В Англії у Центрі прикладної мікробіології був одержаний таким чином високий вихід інсуліну — до 200 г з 1000 л культурального середовища. Ця кількість еквівалентна кількості інсуліну, виділеного приблизно з 1600 кг підшлункової залози свині або корови (Сассон А., 1987).