Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Молекулярная генетика человека
Заключение

Изучая родословные семей, представленных несколькими поколениями, члены которых имеют четко выраженную патологию, можно определить тип наследования многих генетических заболеваний. Зная характер наследования в семьях, можно установить, является ли данное генетическое заболевание аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным, Х-сцепленным доминантным или Х-сцепленным рецессивным, В случае Х-сцепленного заболевания его ген расположен на Х-хромосоме, для аутосомных болезней хромосомная локализация гена неизвестна. Чтобы картировать ген в специфическом районе хромосомы, можно идентифицировать сцепленные с ним маркерные сайты, используя для этого метод ПДРФ и STRP-картирование. Для оценки сцепления между маркерным сайтом и геном заболевания используют метод максимального правдоподобия. Порядок расположения ПДРФ- и STRP-сайтов на хромосоме определяют при помощи анализа наследования гаплотипов в группе семей, представленных тремя поколениями и имеющих большое количество детей (СЕРН-семей). Кроме того, порядок расположения на хромосоме уникальных сайтов, идентифицируемых при помощи ПЦР (STS), можно проверить картированием с использованием радиационных гибридов. Физические карты хромосом (контиги) строят на основе геномных библиотек, содержащих крупные (YAC, ВАС и РАС) и небольшие (космиды, Р1 и λ) фрагменты ДНК человека, используя STS-картирование или другие подходы, в том числе геномную дактилоскопию. Транскрипционные карты состоят из участков кДНК и маркерных экспрессируемых последовательностей (EST), расположенных вдоль хромосомы. Построение генетических, физических и транскрипционных карт облегчает идентификацию и характеристику генов заболеваний.

Аутентичность обнаруженного гена человека можно считать доказанной, если у больных индивидов в нем найдены изменения, отсутствующие в генах здоровых лиц. Для выявления мутаций часто используют анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP).

Для идентификации нужного гена человека используют четыре метода. В первом из них, функциональном картировании, на основе данных о генном продукте синтезируют зонды для скрининга кДНК-библиотеки. Положительный кДНК-клон, содержащий кодирующую область гена-мишени, используют для отбора геномных клонов и характеристики гена в целом. Второй подход, кандидатное картирование, основывается на выборе генов, которые по имеющимся данным могут отвечать за данное генетическое заболевание. В этом случае проводят поиск мутаций в генах-кандидатах у больных и здоровых индивидов и по результатам поиска делают вывод, какой из них является геном заболевания. Третий подход, позиционное картирование, применяют в тех случаях, когда ничего не известно ни о возможном гене заболевания, ни о его продукте. Этот подход весьма трудоемок и имеет множество модификаций. Сначала, используя ПДРФ- или STRP-зонды и данные о семьях с исследуемым наследственным заболеванием, определяют район хромосомы, в котором локализован искомый ген. Затем с помощью зондов, специфичных в отношении тесно сцепленных с ним маркеров, выявляют клоны, охватывающие район локализации гена заболевания проверяют геномные клоны или полученные из них субклоны на наличие в них экзонов. Используя данные о нуклеотидных последовательностях различных экзонов, в той или иной степени соответствующих нуклеотидной последовательности гена заболевания, разрабатывают стратегию поиска мутаций. Четвертый подход, позиционно- кандидатное картирование, состоит в картировании гена заболевания в определенном районе хромосомы, просмотре функциональных генов и маркерных экспрессируемых последовательностей, локализованных в том же хромосомном районе, и выборе тех из них, которые могут являться искомым геном. Чтобы определить, какой именно из генов-кандидатов является таковым на самом деле, используют мутационный анализ.

«Геном человека» — это широкомасштабная исследовательская программа, конечной целью которой является полное секвенирование генома человека. Различные ее направления включают построение генетических и физических карт всех хромосом человека с высоким разрешением; секвенирование геномов различных модельных организмов типа Е. coli, С. elegans, S. сегеvisiae, М. musculus и A. thaliana; создание компьютерных технологий для обработки и анализа данных по генетическому и физическому картированию и секвенированию ДНК; информирование общественности по всем проблемам, связанным с получением и использованием данных по генетике человека, изучение этических, правовых и социальных аспектов генетических исследований. На этом пути уже достигнуты впечатляющие успехи, и есть основания полагать, что геном человека будет секвенирован к 2005 г.

ЛИТЕРАТУРА

Bellane-Chantelot С., В, Lacroix, Р. Ougen, А. Billaull, S. Beaufils, S. Bertrand, I. Georges, F. Gilbert, I. Gros, G. Lucotte, L. Susini, J, Codani, P. Gesnouin, S. Pook, G. Vaysseix, J. Lu-Kuo, T. Ried, D. Ward, I. Chumakov, D. Le Paslier, E. Barillot, D. Cohen. 1992. Mapping the whole human genome by fingerprinting yeast artificial chromosomes. Cell70: 1059—1068.

Botstein D., R. L. White, M. Skolnick, R. W. Davis. 1980. Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314—331.

Chumakov I. M., P. Rigault, I. Le Gall, C. Bellane-Chantelot, A. Billault, S. Guillou, P. Soularue, G. Guasconi, E. Poullier, I. Gros, M. Belova, J. Sambucy, P. Gervy, P. Glibert, S. Beaufils, H. Bui, C. Massart, M. De Tand, F. Dukasz, S. Lecoulant, P. Ougen, V. Perrot, M. Saumier, C. Soravito, R. Behouaylla, A. Cohen-Akenine, E. Barillot, S. Bertrand, J. Codani, D. Caterina, I. Georges, B. Lacroix, G. Lucotte, M. Sahbatou, C. Schmit, M. Sangouard, E. Tubacher, C. Dib, S. Faure, C. Fizames, G. Gyapay, P. Millasseau, S. Nguyen, D. Muselet, A. Vignal, J. Morissette, J. Menninger, J. Lieman, T. Desay, A. Banks, P. Bray-Ward, D. Ward, T. Hudson, S. Gerety, S. Foote, L. Stein, D. C. Page, E. S. Lander, J. Weissenbach, D. Le Paslier, D. Cohen. 1995. A YAC contig map of the human genome. Nature (London) 377(Suppl.): 175—297.

Collins F. S. 1995. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nat. Genet. 9: 347-350.

Collins F., D. Galas. 1993. A new five-year plan for the U.S. Human Genome Project. Science 262: 43-46.

Cooperative Human Linkage Center (CHLC): J. C. Murray, K. H. Buetow, J. L. Weber, S. Ludwigsen, T. Scherpbier-Heddema, P. Manion, J. Quillen, V. C. Sheffield, S. Süden, G. M. Duyk; Genethon: J. Weissenbach, G. Gyapay, C. Dib, J. Morissette, G. M. Lathrop, A. Vignal; University of Utah: R. White, N. Matsunami, S. Gerken, R. Melis, H. Albertsen, R. Plaetke, S. Odelberg; Yale University: D. Ward; Centre d’Etude du Polymorphisme Humain (СЕРН): J. Dausset, D. Cohen, H. Cann, 1994. A comprehensive human linkage map with centimorgan density. Science 265: 2049—2054.

Cox D. R., M. Burmeister, E. R. Price, S. Kim, R. M. Myers. 1990. Radiation hybrid mapping: a somatic cell genetic method for constructing high-resolution maps of mammalian chromosomes. Science 250: 245—250.

Fickett J. W. 1996. Finding genes by computer: the state of the art. Trends Genet. 12: 316—320.

Green E. D., P. Green. 1991. Sequence-tagged site (STS) content mapping of human chromosomes: theoretical considerations and early experiences. PCR Methods Appl. 1: 77—90.

Grompe M. 1993. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids. Nat. Genet. 5: 111-120.

Guyer M. S., F. S. Collins. 1995. How is the Human Genome Project doing, and what have we learned so far? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10841-10848.

Cyapay G., J. Morissette, A. Vignal, C. Dib, C. Fizames, P. Millasseau, S. Marc, G. Bernardi, M. Lathrop, J. Weissenbach. 1994. The 1993—1994 Genethon human genetic linkage map. Nat. Genet. 7: 246—287.

Hudson T. J., L. D. Stein, S. S. Gerety, J. Ma, A. B. Castle, J. Silva, D. K. Slonim, R. Baptista, L. Kruglyak, S. Xu, X. Hu, A. M. E. Colbert, C. Rosenberg, M. P. Peeve-Daly, S. Rożen, L. Hui, X. Wu, C. Vestergaard, К. M. Wilson, J. S. Bae, S. Maitra, S. Ganiatsas, C. A. Evans, M. M. DeAngelis, K. A. Ingalls, R. W. Nahf, L. T. Horton, M. O. Anderson, A. J. Collymore, W. Ye, V. Kouyoumjian, I. S. Zemsteva, J. Tam, R. Devine, D. F. Courtney, M. T. Renaud, H. Nguyen, T. O’Connor, C. Fizames, S. Faure, G. Gyapay, C. Dib, J. Morissette, J. B. Orlin, B. W. Birren, N. Goodman, J. Weissenbach, T. L. Hawkins, S. Foote, D. C. Page, E. S. Lander. 1995. An STS-based map of the human genome. Science 270: 1945—1954.

Knoppers В. М., R. Chadwick. 1994. The Human Genome Project: under an international ethical microscope. Science 265: 2035—2036.

Leppert M., V. E. Anderson, T. Quattlebaum, D. Stauffer, P. O’Connell, Y. Nakamura, J.-M. Lalouel, R. White. 1989. Benign familial neonatal convulsions linked to genetic markers on chromosome 20. Nature (London) 337: 647—648. Ott J. 1992. Analysis of Human Genetic Linkage.

Johns Hopkins University Press, Baltimore, Md. Poustka A., T. M. Pohl, D. P. Barlow, A.-M. Frischauf, H. Lehrach. 1987. Construction and use of human chromosome jumping libraries from Notl-digested DNA. Nature (London) 325: 353-355.

Schuler G. D., M. S. Boguski, E. A. Stewart, L. D. Stein, G. Gyapay, K. Rice, R. E. White, P. Rodriguez-Tome, A. Aggarwal, E. Bajorek, S. Bentolila, В. B. Birren, A. Butler, A. B. Castle, N. Chiannikulchai, A. Chu, C. Clee, S. Cowles, P. J. R. Day, T. Dibling, N. Drouot, L Dunham, S. Duprat, C. East, C. Edwards, J.-B. Fan, N. Fang, C. Fizames, C. Garrett, L. Green, D. Hadley, M. Harris, P. Harrison, S. Brady, A. Hicks, E. Holloway, L. Hui, S. Hussain, C. Louis-Dit-Sully, J. Ma, A. MacGilvery, C. Mader, A. Maratukulam, T. C. Matise, К. B. McKusick, J. Morissette, A. Mungall, D. Muselet, H. C. Nusbaum, D. C. Page, A. Peck, S. Perkins, M. Piercy, F. Qin, J. Quackenbush, S. Ranby, T. Reif, S. Rozen, C. Sanders, X. She, J. Silva, D. K. Slonim, C. Soderlund, W.-L. Sun, P. Tabar, T. Thangarajah, N. Vega- Czamy, D. Vollrath, S. Voyticky, T. Wilmer, X. Wu, M. D. Adams, C. Auffray, N. A. R. Walter, R. Brandon, A. Dehajia, P. N. Goodfellow, R. Houlgatte, J. R. Hudson, Jr., S. E. Ide, K. R. Iorio, W. Y. Lee, N. Sęki, T. Nagase, К Ishikawa, N. Nomura, C. Phillips, M. H. Polymeropoulos, M. Sandusky, K. Schmitt, R. Веrrу, K. Swanson, R. Torres, J. C. Venter, J. M. Sikela, J. S. Beckmann, J. Weissenbach, R. M. Myers, D. R. Cox, M. R. James, D. Bentley, P. Deloukas, E. S. Lander, T. J. Hudson. 1996. Agene map of the human genome. Science 21 A: 540—546.

Taylor K., N. Homigold, D. Conway, D. Williams, Z. Ulinowski, M. Agochiya, P. Fattorini, P. De Jong, P. F. R. Little, J. Wolfe. 1996. Mapping the human Y chromosome by fingerprinting cosmid clones. Genome Res. 6: 235—248.

Terwilliger J. D., J. Ott. 1994. Handbook of Human Genetic Linkage. Johns Hopkins University Press, Baltimore, Md.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что такое независимое наследование аллелей?

2. Нарисуйте родословную, включающую четыре поколения, у членов которой встречается заболевание, имеющее аутосомно-доминантный тип наследования. Пенетрантность заболевания составляет 70%. Что такое пенетрантность? Как неполная пенетрантность влияет на изучение генетических заболеваний человека?

3. Что такое лод-балл? Как он определяется?

4. Что такое генетический полиморфизм? Почему полиморфные локусы важны для картирования генов заболеваний человека?

5. Как с помощью STRP-зондов можно локализовать ген заболевания человека?

6. Что такое банк СЕРН-семей? Как он «работает»?

7. Что такое STS? Как определяют хромосомную локализацию STS?

8. Что такое контиг? Опишите подробно, как строится контиг хромосомы.

9. Как установить, что вставка геномного клона содержит кодирующую область гена?

10. Каково теоретическое обоснование позиционно-кандидатного картирования гена?