Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Основы молекулярной биотехнологии
Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах
Повышение эффективности секреции
Стабильность белков, кодируемых клонированными генами, зависит от их клеточной локализации. Например, рекомбинантный проинсулин оказывается примерно в 10 раз более стабильным, если он секретируется (экспортируется) в периплазму (пространство между плазматической и наружной мембранами), а не остается в цитоплазме. Кроме того, белки, секретируемые в периплазму или в среду, легче очистить.
Обычно транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают N-концевые аминокислотные последовательности, называемые сигнальными пептидами (сигнальными последовательностями, лидерными пептидами). Иногда удается сделать белок секретеруемым, присоединив к кодирующему его гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез сигнального пептида. Однако простое наличие сигнального пептида не обеспечивает эффективной секреции. Кроме того, Е. coli и другие грамотрицательные микроорганизмы обычно не могут секретировать белки в окружающую среду из-за наличия наружной мембраны. Есть по крайней мере два способа решения этой проблемы. Первый — использование грамположительных про- или эукариот, лишенных наружной мембраны, второй — создание грамотрицательных бактерий, способных секретировать белки в среду, с помощью генной инженерии.
Если слияние гена-мишени с фрагментом ДHК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отношении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Ха. Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации Е. coli, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Ха, получили функциональный интерлейкин-2.
По данным одной из работ, секреция многих гетерологичных белков в Е. coli зависит от уровня экспрессии соответствующих генов. Чужеродные белки, синтезируемые наиболее активно, не обязательно столь же активно секретеруются. Иногда интенсивный синтез чужеродного белка вызывает перегрузку секреторного аппарата и его блокирование. Таким образом, если нужно, чтобы данный белок непременно секретировался, то можно попытаться понизить уровень экспрессии соответствующих генов.
Некоторые грамотрицательные бактерии секретируют в среду белок, называемый бактериоцином. Он активирует фосфолипазу А, локализованную во внутренней мембране бактериальной клетки, в результате чего и внутренняя, и наружная мембраны становятся проницаемыми, и некоторые цито- и периплазматические белки высвобождаются в культуральную среду. Таким образом, можно встроить ген бактериоцина в плазмиду так, чтобы он находился под контролем сильного регулируемого промотора, трансформировать клетки Е. coli этой плазмидой и сделать их проницаемыми. Если же Е. coli уже несут ген бактериоцина, их можно трансформировать другой плазмидой, которая содержит ген нужного белка, сшитый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид. Если оба гена находятся под контролем одного промотора, то их можно индуцировать одновременно, и белок клонированного гена будет секретироваться в среду.
Когда секретируемые чужеродные белки образуются в Е. coli в слишком большом количестве, очень часто процессинг претерпевают не все белки-предшественники: примерно половина секретированных белков сохраняет лидерную последовательность, а другая половина полностью процессируется с образованием зрелой формы. Это может быть связано с недостатком каких-то белков, участвующих в секреции. В такой ситуации, чтобы увеличить долю процессированных белков, можно попытаться повысить уровень экспрессии генов, ответственных за синтез лимитирующих компонентов секретирующей системы. Для проверки этого предположения были поставлены следующие эксперименты. Плазмиду, несущую гены prlA4 и secE, которые кодируют основные компоненты молекулярного механизма, ответственного за физическое перемещение белков через мембрану, ввели в клетки Е. coli. После такого усиления секреторного аппарата хозяйской клетки доля рекомбинантного белка (цитокина интерлейкина-6), секретируемая в плазмиду в зрелой форме, увеличилась с 50 до более чем 90%.
Грибы Aspergillus секретируют в среду большое количество ферментов и широко используются для их промышленного производства. В одной из работ осуществили слияние гена человеческого интерферона с геном сигнального пептида, ответственного за секрецию, и поместили эту конструкцию под контроль глюкоамилазного промотора Aspergillus nidulam, индуцируемого крахмалом. После добавления последнего в среду с трансформированными клетками Aspergillus nidulam выход секретируемого человеческого интерферона достиг 1 мг на 1 л, что эквивалентно примерно 5% всего секретируемого клеточного белка. Эта работа показывает, что стратегии модулирования генной экспрессии, разработанные для Е. coli, можно использовать и применительно к другим биологическим системам.