Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Молекулярная диагностика
Заключение
Любой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени; 2) достаточно чувствительным для выявления небольших количеств мишени; .3) достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики: один основан на сродстве антитела к конкретному антигену, другой — на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации или ПЦР.
Наиболее распространенным иммунологическим методом является ELISA. Вкратце он состоит в следующем: 1) фиксация образца на твердой подложке; 2) добавление первого антитела, специфичного к антигену-мишени, и его связывание с антигеном-мишенью; 3) добавление конъюгата второе антитело—фермент, который присоединяется к первому антителу; 4) добавление неокрашенного субстрата, который под действием фермента, входящего в состав конъюгата, превращается в окрашенное соединение. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.
ELISA применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения низкомолекулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. При этом для уменьшения стоимости прибегают к технике клонирования их фрагментов в Е. coli и получают комбинаторную библиотеку, а на ее основе — широкий спектр комбинаций Fv-фрагментов.
Высокочувствительным и специфичным методом обнаружения нуклеотидных последовательностей в биологических образцах является гибридизация. Его использовали при разработке способов идентификации патогенных микроорганизмов в клинических образцах и различных микроорганизмов в окружающей среде.
ДНК-диагностика основывается на обнаружении известных нуклеотидных последовательностей; для этого синтезируют специфические праймеры и амплифицируют последовательность-мишень. Это позволяет использовать нерадиоактивные системы детекции (например, хемилюминесцентный метод) или регистрировать ПЦР-продукты методом гель-электрофореза. Кроме того, ПЦР-продукты можно пометить флуоресцентным красителем, присоединив его к 5'-концу праймера.
В судебной медицине все более широкое применение находит метод геномной дактилоскопии, основанный на том, что ДНК каждого человека образует уникальный набор гибридизационных полос. При этом в качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК человека, которые не кодируют никаких белков и отличаются высокой вариабельностью.
Для характеристики ДНК растений используют набор произвольных олигонуклеотидных праймеров, проводят ПЦР-амплифицикацию случайных фрагментов ДНК, осуществляют электрофорез и получают специфичный для каждого растения набор полос ДНК; данный подход носит название RAPD.
Методы ДНК-диагностики применяют также для обнаружения толковых мутаций в данном гене. Один из подходов заключается в лигировании двух олигонуклеотидных праймеров. При несоответствии всего одного нуклеотида в месте стыковки гибридизовавшихся олигонуклеотидов лигирования не происходит.
ЛИТЕРАТУРА
Barany F. 1991. Single-nucleotide genetic disease detection using cloned thermostable ligase. Proc. 1991 Miami. Bio/Technol. Winter Symp. 1: 88. Barker R. H., L. Suebsaeng, W. Rooney, G.C. Alecrim, H. V. Dourado, D. F. Wirth. 1986. Specific DNA probe for the diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. Science 231: 14.34—1436.
Buga wan T. L., R. K. Saiki, С. H. Levenson, R. M. Watson, H. A. Erlich. 1988. The use of nonradioactive oligonucleotide probes to analyze enzymatically amplified DNA for prenatal diagnosis and forensic HLA typing. Bio/Technology 6:943—947.
Carlson D. P., C. Superko, J. Mackey, M. E. Gaskill, P. Hansen. 1990. Chemiluminescent detection of nucleic acid hybridization, Focus 12: 9—12.
Caskey С. T. 1987. Disease diagnosis by recombinant DNA methods. Science 236: 1223—1229.
Chehab F. F., Y. W. Kan. 1989. Detection of specific DN A sequences by fluorescence amplification: a color complementation assay. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 9178-9182.
Debenham P. G. 1992. Probing identity: the changing face of DNA fingerprinting. Trends Biotechnol. 10: 96—102.
Erlich H. A., D. Gelfand, J. J. Sninsky. 1991. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science 252: 1643—1651.
Gillam 1. C. 1987. Non-radioactive probes for specific DNA sequences. Trends Biotechnol. 5: 332-334.
Hartskeerl R. A., M. Y. L., De Wit, P. R. Klatser. 1989 Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae. J. Gen. Microbiol. 135: 2357-2364.
Jeffreys A. J., A. MacLeod, K. Tamaki, D. L. Neil, D. G. Monckton. 1991. Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing. Nature 354: 204-209.
Kingsbury D. T. 1987. DNA probes in the diagnosis of genetic and infectious diseases. Trends Biotechnol. 5: 107—111.
Kievan L., G. Gebeyehu. 1990. Biotinylated nucleotides for labeling and detecting DNA. Methods Enzymol. 184: 561—577.
Kohler G., C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495—497.
Kuppuswamy M. N., J. W. Hoffmann, С. K. Kasper, S. G. Spitzer, S. L. Groce, S. P. Bajaj. 1991. Single nucleotide primer extensioin to detect genetic diseases: experimental application to hemophilia В (factor IX) and cystic fibrosis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-1147.
Mathews J. A., L. J. Kricka. 1988. Analytical strategies for the use of DNA probes. Anal. Biochem. 169: 1-25.
Nickerson D. A., R. Kaiser, S. Lappin, J. Stewart, L. Hood, U. Landegren. 1990. Automated DNA diagnostic using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8923-8927.
Persing D. Н., Т. F. Smith, F. С. Tenover, Т. J. White (ed.). 1993. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. Ametican Society for Microbiology, Washington, D.C.
Plikaytis В. B., R. H. Gelber, T. M. Shinnick. 1990. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium leprae using a nested-primer gene amplification assay. J. Clin. Microbiol. 28: 1913—1917.
Pollard-Knigth D., A. C. Simmonds, A. P. Schaap, H. Akhavan, M. A. W. Brady. 1990. Nonradioactive DMA detection on Southern blots by enzymatically triggered chemiluminescence. Anal. Biochem. 185: 353—358.
Rafalski J. A., S. V. Tingey. 1993. Genetic diagnostics in plant breeding: RAPDs, microsatellites and machines. Trends Genet. 9: 275—279.
Saiki R. К., P. S. Walsh, С. H. Levenson, H. A. Erlich. 1989. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6230—6234.
Sayler G. S., A. C. Layton. 1990. Environmental application of nucleic acid hybridization. Annu. Rev. Microbiol. 44: 625—648.
Tyagi S., F. R. Kramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluorescence upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14: 303—308.
Waldmann T. A. 1991. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252: 1657—1662.
Weiss J. B. 1995. DNA probes and PCR for diagnosis of parasitic infections. Clin. Microbiol. Rev. 8: 113-130.
White T. J., N. Arnheim, H. A. Erlich. 1989. The polymerase chain reaction. Trends Genet. 5: 185-188.
White T. J., R. Madej, D. H. Persing. 1992. The polymerase chain reaction: clinical applications. Adv. Clin. Chem. 29: 161—196.
Winter G., C. Milstein. 1991. Man-made antibodies. Nature 349: 293-299.
Yu K. F., A. Van Deynze, К. P. Pauls. 1993. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, p. 287—301. In B.R. Glick and J.E. Thompson (ed.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Кратко опишите, как с помощью ПЦР можно выявить изменения в гене ß-глобина человека, приводящие к серповидноклеточной анемии.
2. Изложите принцип метода ПЦР/ЛОЗ.
3. Что такое метод ELISA?
4. Опишите три способа нерадиоактивного мечения ДНК. Каковы преимущества нерадиоактивных методов детекции?
5. Перед вами стоит задача разработать простой, чувствительный и воспроизводимый тест для обнаружения содержащего двухцепочечную ДНК вируса, вызывающего летальную инфекцию у крупного рогатого скота. Поскольку эффективность лечения зависит от ранней и точной диагностики заболевания, необходимо использовать методы, позволяющие выявлять вирус при его минимальном содержании в организме инфицированного животного, еще до появления каких-либо симптомов заболевания. Кратко опишите и обоснуйте последовательность ваших действий.
6. Что означают чувствительность, специфичность и простота применительно к диагностическим тестам?
7. Как в настоящее время диагностируют болезнь Чагаса? Каким образом можно усовершенствовать существующую процедуру?
8. Почему использование флуоресцентных красителей облегчает обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей?
9. Что такое зонд — «молекулярный маяк» и как он действует?
10. Что такое геномная дактилоскопия и как ее используют для характеристики следовых количеств ДНК в судебной медицине?
11. Что представляет собой метод RAPD и как его используют для выявления генетических вариантов растительных культур?