Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Бактерии, стимулирующие рост растений
Нитрогеназа

Интерес к диазатрофам как к биологическим удобрениям возродился после того, как были разработаны методы выделения и модификации генов, и это стимулировало изучение биохимических и молекулярно-биологических механизмов фиксации азота. Ученые надеялись, что благодаря этим исследованиям удастся создать более эффективные азотфиксирующие микроорганизмы, способствующие повышению урожайности сельскохозяйственных культур, а некоторые исследователи даже предполагали ввести бактериальные гены фиксации азота непосредственно в растения, чтобы такие растения могли сами фиксировать азот. И хотя эти чересчур смелые планы не удалось осуществить, процесс фиксации азота был детально изучен, так что возможность генноинженерного усовершенствования некоторых диазотрофов стала более реальной.

Компоненты

Все известные нитрогеназы содержат два кислородчувствительных компонента: І и II. Компонент I — это комплекс из двух а-субъединиц (массой примерно 50 000 Да каждая), двух ß- субъединиц (примерно 60 000 Да каждая), 24 молекул железа, двух молекул молибдена и железомолибденового кофактора, обозначаемого FeMoCo (рис. 14.1). Компонент II состоит из двух а-субъединиц (примерно 32 000 Да каждая) и из неизвестного числа молекул железа, причем его а-субъединицы не аналогичны таковым в компоненте I. Для фиксации азота необходимы оба компонента, комплекс магния и АТР, а также источник восстановительных эквивалентов:

Рис. 14.1. Предполагаемая структура железомолибденового кофактора, связанного с молекулой азота (N₂).

Помимо фиксации азота, нитрогеназа катализирует также восстановление газообразного ацетилена до этилена:

Определяя с помощью газовой хроматографии количество синтезированного этилена, можно оценивать активность нитрогеназы. Определения можно проводить на целых клетках в растворе (рис. 14.2), на бактериях, ассоциированных с корнями растений, на грубых экстрактах клеток или на высокоочишенных препаратах фермента. Компонент I катализирует собственно восстановление N₂, а компонент II служит донором электронов. Оба они чрезвычайно чувствительны к кислороду и при слишком высоких его концентрациях быстро и необратимо инактивируются. Функционирование нитрогеназы зависит также от 15—20 вспомогательных белков. Роль некоторых из них состоит в передаче электронов компоненту II, а также в биосинтезе железомолибденового кофактора.

Рис. 14.2. Определение активности нитрогеназы по восстановлению ацетилена до этилена. А. Бактерии (в культуре или ассоциированные с корнями растения), синтезирующие нитрогеназу, либо препарат очищенного фермента (не показано) помещают в герметичную емкость в атмосферу ацетилена. Б. Из емкости периодически отбирают пробы и методом газовой хроматографии измеряют количество ацетилена и этилена. Активность нитрогеназы пропорциональна количеству образовавшегося этилена.

Генная инженерия кластера генов нитрогеназы

Фиксация азота — очень сложный процесс, требующий согласованного действия множества разных белков. Поэтому вряд ли можно было ожидать, что вся генетическая информация, необходимая для фиксации азота, будет содержаться в каком-то одном фрагменте ДНК и что этот фрагмент удастся вычленить из генома диазотрофного микроорганизма и перенести в недиазотрофный организм. Следует еще учесть, что физиологические условия в организме реципиента должны быть подходящими для функционирования активной нитрогеназы. Более приемлемый способ выделения генов азотфиксации («nif-генов) состоял в том, чтобы идентифицировать и охарактеризовать те клоны библиотеки ДНК дикого типа, которые восстанавливают способность различных мутантов данного микроорганизма фиксировать азот. Такой метод называется генетической комплементацией.

Первые «nif-гены, идентифицированные методом комплементации, были выделены из банка клонов диазотрофной бактерии Klebsiella pneumoniae. Эта хорошо изученная энтеробактерия, которая обнаруживается в почве и воде, а также в кишечнике человека. Схема выделения состоит в следующем (рис. 14.3).

1. Клетки К. pneumoniae обрабатывают такой дозой мутагена, чтобы выживаемость составила примерно 0,1—1,0%. Некоторые из мутантных клеток, способные расти на минимальной среде, содержащей источник связанного азота типа NH₄Cl, но не в отсутствие связанного азота, вероятно, несут мутацию в nif-гене; их обозначают Nif^-.

2. Используя экспрессирующие плазмидные векторы с широким кругом хозяев, создают банк клонов хромосомной ДНК К. pneumoniae дикого типа (Nif⁺) и поддерживают его в Е. coli.

3. Проводят конъюгацию Nif^--клеток К. pneumoniae с клетками Е. coli, несущими банк клонов в плазмидных векторах.

4. Трансформированные клетки К. pneumoniae, приобретшие фенотип Nif⁺, отбирают, высевая их на минимальную среду, не содержащую источника связанного азота. В этих условиях растут только Nif^--клетки К. pneumoniae с плазмидой, кодирующей белок, который отсутствует или не функционирует в Nif^--мутанте.

Фрагмент ДНК в плазмиде, комплементирующий хромосомную мутацию Nif^-, содержит nif-ген, который можно детально охарактеризовать и использовать для выделения других nif-генов.

Для выделения других генов, участвующих в фиксации азота, применяли два подхода. Во-первых, использовали банк клонов К. pneumoniae для комплементации независимо возникающих Nif^--мутантов, увеличивая тем самым вероятность того, что в каждом случае будет выделен другой «nif-ген. Во-вторых, выделенные «nif-гены использовали в качестве гибридизационных зондов для скрининга банка клонов хромосомной ДНК К. pneumoniae, несущих большие вставки (от 7 до 10 т. п. н.), исходя из того, что у прокариот гены одного пути биосинтеза обычно образуют кластеры. В результате всесторонних исследований был идентифицирован и охарактеризован весь набор «nif-генов К. pneumoniae. Эти гены организованы в один кластер длиной примерно 24 т. п. н. (рис. 14.4), который содержит семь отдельных оперонов, кодирующих в общей сложности 20 разных белков (табл. 14.2). Для того чтобы образовалась активная нитрогеназа, все «nif-гены должны транскрибироваться и транслироваться одновременно (под регуляторным контролем nifА- и «nifL-генов). Белок NifA — это активатор транскрипции всех «nif-оперонов, кроме своего собственного. Он связывается со специфической последовательностью ДНК (5'-TGT-N₁₀-ACA-3'), которая находится в каждом промоторе каждого nif-оперона. Сайт связывания белка NifА находится примерно в 80—150 нуклеотидах перед каждым сайтом инициации транскрипции. Перед началом транскрипции с «nif-промотора связавшийся с ДНК белок NifA взаимодействует со специфическим белком инициации транскрипции а⁵⁴. Белок NifL — репрессор. В присутствии либо кислорода, либо связанного азота он действует как антагонист NifA и в результате ингибирует транскрипцию всех других «nif-генов.

Таблица 14.2. Гены К. pneumoniae, участвующие в фиксации азота, и кодируемые ими белки (или функции)

Рис. 14.3. Выделение «nif-генов методом генетической комплементации. Для комплементации Nif^--штамма К. pneumoniae используется банк клонов ДНК Nif⁺-клеток. Трансформированные клетки отбирают по их способности расти на минимальной среде, не содержащей связанного азота.

Рис. 14.4. Расположение «nif-генов в кластере и некоторые кодируемые ими функции. Гены обозначены заглавными буквами: красная стрелка под каждой из групп этих букв обозначает специфический nif-оперон и указывает направление его транскрипции. Стрелки, отходящие от обозначений генов, показывают, какое участие в фиксации азота принимают продукты некоторых из этих генов. F — флаводоксин, FO — пируват : флаводоксин оксидоредуктаза.

Роль К. pneumoniae в общем биологическом процессе связывания азота не является основной. Поэтому в целях модификации процесса фиксации азота почвенными бактериями, представляющими большой интерес с точки зрения стимуляции роста растений, были клонированы и охарактеризованы «(nif-гены из других источников. При этом «nif-гены К. pneumoniae использовались в качестве гибридизационных зондов для выделения соответствующих генов из банков клонов других диазотрофных микроорганизмов. Большинство диазотрофов имеет сходный набор генов, кодирующих аппарат фиксации азота, и последовательности ДНК этих генов у разных организмов мало различаются.

Принимая во внимание результаты молекулярно-генетических исследований, вероятно, можно повысить уровень фиксации азота диазотрофными бактериями, модифицируя nifA- и nifL-гены. После введения с помощью методов генной инженерии дополнительных копий nifA-гена. в штамм Rhizobium meliloti растения люцерны, зараженные этим рекомбинантным штаммом, достигали больших размеров и давали больше биомассы, чем растения, обработанные нетрансформированным штаммом. По-видимому, аналогичным образом можно поступить с «nifL-геном, так чтобы белок NifL (негативный регуляторный фактор) стал бы менее чувствительным к присутствию связанного азота. При таком нарушении регуляции микроорганизм поставлял бы больше азота своему симбиотическому партнеру. Однако имеющиеся данные указывают на то, что не все азотфиксирующие организмы синтезируют белок NifL (у некоторых из них существенные области NifL могут быть составной частью NifA), так что подобный подход не является универсальным. Кроме того, увеличение количества азота, которое может фиксировать микроорганизм, приводит к увеличению количества энергии (обычно в форме связанного углерода), необходимой для обеспечения метаболизма. Следовательно, рекомбинантный микроорганизм может оказаться неспособным стимулировать рост растения просто вследствие замедления своего роста.

Имея в виду всю сложность процесса фиксации азота микроорганизмами, можно сделать вывод, что простого введения в недиазотрофную клетку-реципиент одного или двух nif-генов недостаточно для того, чтобы она приобрела способность связывать азот. Более того, даже введение в геном растений полного кластера «nif-генов длиной 24 т. п. н. не даст необходимого эффекта, поскольку при той концентрации кислорода, которая характерна для растительной клетки, нитрогеназа инактивируется. Если же концентрацию кислорода понизить, то растительная клетка вероятнее всего погибнет. Но в первую очередь попытки создания растительных клеток, способных связывать азот, требуют решения фундаментальных проблем транскрипции, трансляции и регуляции. Например, трудно представить, как будет осуществляться регуляция фиксации, поскольку у растений нет промоторов, с которыми связывался бы белок NifA. Следовательно, в таком трансгенном растении транскрипция nif-генов не будет инициироваться. Кроме того, чтобы реагировать на уровень связанного азота в клетке, все «nif-гены должны находиться под контролем отдельных промоторов, поскольку растительные клетки неспособны процессировать мультигенные транскрипты. Учитывая все сказанное выше, приходится констатировать, что создание растений, способных фиксировать азот, вряд ли возможно.