Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Микробные инсектициды
Заключение
В настоящее время микробиологические инсектициды получают все более широкое распространение благодаря тому, что они не оказывают вредного воздействия на окружающую среду. Некоторые подвиды бактерии Bacillis thuringiensis образуют протоксин, который, попадая в кишечник насекомого, в условиях щелочной среды и под действием пищеварительных протеаз превращается в активный токсин и вызывает гибель насекомого. Летальное действие токсина обусловливается образованием в мембранах клеток кишечника ионных каналов, через которые АТР выходит из клеток. Это приводит к нарушению метаболизма, прекращению питания, дегидратации и т. д. Токсины В. thuringiensis высокоспецифичны в отношении ограниченного числа видов насекомых и нетоксичны для всех остальных; они разрушаются в окружающей среде и поэтому редко оказывают ощутимое влияние на нее, что не способствует отбору устойчивых к ним насекомых. Благодаря всем этим свойствам биологические инсектициды являются перспективными кандидатами на роль агентов, с помощью которых можно контролировать численность насекомых, причиняющих ущерб сельскохозяйственным культурам, и насекомых — переносчиков болезней человека.
Клонированы и охарактеризованы гены различных токсинов В. thuringiensis. Один из таких генов был введен в неспорулирующий штамм Bacillus. При этом ген экспрессировался на всех стадиях развития микроорганизма, а не только на стадии образования спор, когда формируется параспоральный кристалл.
Чтобы расширить специфичность токсина В. thuringiensis, гены различных токсинов встраивали в плазмиды и вводили в хозяйский штамм — либо в составе плазмид с широким кругом хозяев, либо путем интеграции в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Бактерии, несущие два разных токсиновых гена, иногда оказывались токсичными для какого-то третьего вида насекомого-вредителя, а не только для тех двух видов насекомых, на которых действовали продукты исходных генов. С помощью генетических манипуляций был создан рекомбинантный белок, состоящий из двух доменов, кодируемых разными генами В. thuringiensis. Он оказывал двоякое токсическое действие. В ходе другого эксперимента рецепторсвязывающий домен одного токсина был объединен с обладающим токсичностью доменом другого. Есть надежда, что применение таких гибридов уменьшит вероятность появления устойчивых насекомых.
Гены токсинов В. thuringiensis вводили также в различные обитающие в поверхностном слое воды микроорганизмы, которые служат пищей для личинок комаров. Этот подход оказался весьма эффективным для прямой доставки токсинов В. thuringiensis в организм насекомого-мишени. Генноинженерными методами были созданы также бактерии, обитающие в ризосфере и экспрессирующие гены токсинов В. thuringiensis. Это позволяет бороться с насекомыми, повреждающими корни растений.
Бакуловирусы патогенны для многих видов насекомых, но каждый их штамм специфичен в отношении небольшого числа видов. Обычно гибель инфицированного насекомого происходит лишь спустя довольно длительное время, поэтому бакуловирусы не очень эффективны как средство контроля численности насекомых. Однако в различные штаммы бакуловирусов можно ввести специфические гены, и тогда вирус может действовать как система доставки гена, обеспечивающего синтез инсектицида в течение всего жизненного цикла вируса. Проведены предварительные испытания в лабораторных условиях, которые дали положительные результаты. Кроме того, в бакуловирус был введен ген нейротоксина, смертельного для насекомых, и были проведены полевые испытания.
ЛИТЕРАТУРА
Ananda Kumar Р., R. Р. Sharma, V. S. Malik. 1996. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis. Adv. Appl. Microbiol. 42: 1—43.
Baum J. A., T. Malvar. 1995. Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. 18: 1—12.
Bonning В. С., B. D. Hammock. 1992. Development and potential of genetically engineered viral insecticides. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 455—489.
Bosch D., B. Schipper, H. van der Kleij, R. A. de Maagd, W. J. Stiekema. 1994. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management. Bio/Technology 12: 915—918.
Calogero S., A. M. Albertini, С. Fogher, R. Marzari, A. Galizzi. 1989. Expressiion of a cloned Bacillus thuringiensis delta-endotoxin gene in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 55: 446—453.
Caramori T., A. M. Albertini, A. Galizzi. 1991. ln vivo generation of hybrids between two Bacillus thuringiensis insect-toxin-encoding genes. Gene 98: 37-44.
Chejanovsky N., N. Ziiberberg, H. Rivkin, E. Ziotkin, M. Guervitz. 1995. Functional expression of an alpha anti-insect scorpion neurotoxin in insect cells and lepidopterous larvae. FEBS Lett. 376: 181-184.
Chungjatupornchai W. 1990. Expression of the mosquitocidal-protein genes of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and the herbicide-resistance gene bar in Synechocystis PCC6803. Curr. Microbiol. 21: 283—288.
Cory J. S., M. L. Hirst, T. Williams, R. S. Hails, D. Goulson, В. M. Green, T. M. Carty, R. D. Possee, P. J. Cayley, D. H. L. Bishop. 1994. Field trial of a genetically improved baculovirus insecticide. Nature 370: 138—140.
Crickmore N., C. Nicholls, D. J. Earp, T. C. Hodgman, D. J. Ellar. 1990. The construction of Bacillus thuringiensis strains expressing novel entomocidal δ-endotoxin combinations. Biochem. J. 270: 133-136.
Croizier G., L. Croizier, O. Argaud, D. Poudevigne. 1994. Extension of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus host range by interspecific replacement of a short DNA sequence in the p143 helicase gene. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 91: 48-52.
Ferre J., M. D. Real, J. Van Rie, S. Jansens, M. Peferoen. 1991. Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in a field population of Plutella xylostella is due to a change in a midgut membrane receptor. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 88: 5119-5123.
Fuxa J. R. 1991. Insect control with baculoviruses. Biotechnol. Adv. 9: 425—442. Ge A. Z., N. I. Shivarova, D. H. Dean. 1989. Location of the Bombyx mori specificity domain on a Bacillus thuringiensis 6-endotoxin protein. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 4037-4041.
Gelernter W., G. E. Schwab. 1993. Transgenic bacteria, viruses, algae and other microorganisms as Bacillus thuringiensis toxin delivery systems, p. 89—104. In P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey, S. Higgs (ed.), Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory and Practice. Johm Wiley & Sons, Chichester, United Kingdom. Hammock B. D., В. C. Bоnning, R. D. Possee, T. N. Hanzlik, S. Maeda. 1990. Expressioin and effects of the juvenile hormone esterase in a bacuiovirus vector. Nature 344: 458—461.
Held G. A., L. A. Bulla, E. Ferrari, J. Hoch, A. I. Aronson, S. A. Minnich. 1982. Cloning and localization of the lepidopteran protoxin gene of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 79: 6065—6069.
Herrera G., S. J. Snyman, J. A. Thomson. 1994. Construction of a bioinsecticidal strain of Pseudomonas fluorescens active against the sugarcane borer, Eldana saccharina. Appl. Environ. Microbiol. 60: 682—690.
Kalman S., K. L. Kiehne, N. Cooper, M. S. Reynoso, T. Yamamoto. 1995. Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes. Appl. Environ. Microbiol. 61: 3063-3068.
Lampel J. S., G. L. Canter, M. B. Dimock, J. L. Kelly, J. J. Anderson, B. B. Uratani, J. S. Foulke, Jr., J. T. Turner. 1994. Integrative cloning, expression, and stability of the crylA(c) gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki in a recombinant strain of Clavibacter xyli subsp. cynodontis. Appl. Environ. Microbiol. 60: 501-508.
Lereclus D., H. Agaisse, M. Gominet, J. Chaufaux. 1995. Overproduction of encapsulated insecticidal crystal proteins in a Bacillus thuringiensis spoOA mutant. Bio/Technology 13: 67—71.
Lereclus D., A. Delecluse, M. M. Lecadet. 1993.
Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes, p. 37—69. In P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey, S. Higgs (ed.), Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory and Practice. John Wiley & Sons, Chichester, United Kingdom.
Liu J. T., M. J. Sui, D. D. Ji, I. H. Wu. С. C. Chou, С. C. Chen. 1993. Protection from ultraviolet radiation by melanin of mosquitocidal activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis. J. Invertebr. Pathol. 62: 131 — 136.
Liu J. W., W. H. Yap, T. Thanabaiu, A. G. Porter. 1996. Efficient synthesis of mosquitocidal toxins in Asticcacaulis excentricus demonstrates potential of gramnegative bacteria in mosquito control. Nat. Biotechnol. 14: 343- 347.
Maeda S. 1995. Further development of recombinant baculovirus insecticides. Curr. Opirt. Biotechnol. 6: 313—319.
McCutchen B. F., P. V. Choudary, R. Crenshaw, D. Maddox, S. G. Kamita, N. Palekar, S. Volrath, E. Fowler, B. D. Hammock, S. Maeda. 1991. Development of a recombinant baculovirus expressing an insect-selective neurotoxin: potential for pest control. Bio/Technology 9: 848—852.
Mettus A. M., A. Macaluso. 1990. Expression of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin genes during vegetative growth. Appl. Environ. Microbiol. 56: 1128-1134.
Murphy R. С., E. S. Stevens. 1991. Cloning and expression of the crylVD gene of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis in the cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 and its resulting larvicidal activity. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1650—1655.
Obukowicz M. G., F. J. Perlak, К. Kusano-Kretzmer, E. J. Mayer, S. L. Bolten, L. S. Watrud. 1986. Tn5-mediated integration of the delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis into the chromosome of root-colonizing pseudomonads. J. Bacteriol. 168: 982-989.
Obukowicz M. G., F. J. Perlak, К. Kusano- Kretzmer, E. J. Mayer, L. S. Watrud. 1986. Integration of the delta-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis into the chromosome of root-colonizing strains of pseudomonads using Tn5. Gene 45: 327-331.
Priest F. G. 1992. Biological control of mosquitoes and other biting flies by Bacillus sphaericus and Bacillus thuringiensis. J. Appl. Bacteriol. 72: 357-369.
Schnepf H. E., H. R. WhiteIey. 1981. Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2893-2897.
Stewart L. M. D., M. Hisrt, M. L. Ferber, A. T. Merryweather, P. J. Cayley, R. D. Possee. 1991. Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect-specific toxin gene. Nature 352: 85—88.
Thanabaiu T., J. Hindley, S. Brenner, C. Oei, C. Berry. 1992. Expression of the mosquitocidal toxins of Bacillus sphaericus and Bacillus thuringiensis subsp. israelensis by recombinant Caulobacter crescentus, a vehicle for biological control of aquatic insect larvae. Appl. Environ. Microbiol 58: 905—910.
Thiery I., L. Nicholas, R. Rippka, N. Tandeau de Marsac. 1991. Selection of cyanobacteria isolated from mosquito breeding sites as a potential food source for mosquito larvae. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1354—1359.
Fornalski M. D., L. K. Miller. 1991. Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxin gene. Nature 352: 82—84.
Van Rie J., W. H. McGaughey, D. E. Johnson, B. D. Barnett, H. Van Mellaert. 1990. Mechanism of insect resistance of the microbial insecticide Bacillus thuringiensis. Science 247:12—1A.
Wood H. A., R. R. Granados. 1991. Genetically engineered baculoviruses as agents for pest control. Annu. Rev. Microbiol. 45: 69—87.
Vap W. H., T. Thanabaiu, A. G. Porter. 1994. Expression of mosquitocidal toxin genes in a gasvacuolated strain of Ancylobacter aquaticus. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4199—4202.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Каковы преимущества биологических инсектицидов перед химическими?
2. Почему токсин Bacillus thuringiensis не токсичен для человека?
3. Какой подход вы использовали бы для идентификации гена протоксина Bacillus thuringiensis subsp. israilensis? Какое практическое применение может найти этот ген?
4. Как выяснить, где локализован ген определенного протоксина: в плазмиде или в хромосомной ДНК В. thuringiensis?
5. Как с помощью генной инженерии можно улучшить полезные свойства того или иного протоксина В. thuringiensis?
6. Как, используя методы генной инженерии, повысить эффективность бакуловирусов как инсектицидных агентов?
7. Каким образом можно расширить видоспецифичность токсинов?
8. Какую информацию вы можете получить, зная, к какому классу относится тот или иной белок Cry?
9. Как бы вы модифицировали белок Cry, чтобы уменьшить вероятность появления насекомых, уcтойчивых к токсину?
10. Почему бактерия Asticcacaulis excentricus является весьма привлекательным микроорганизмом для осуществления в ней экспрессии генов токсинов В. thuringiensis?
11. Как расширить круг насекомых, инфицируемых данным бакуловирусом?