Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов
Заключение

Для крупномасштабного культивирования рекомбинантных микроорганизмов в промышленных биореакторах (>1000 л) недостаточно просто экстраполировать условия роста в лабораторных ферментерах (0,1—1,0 л). При конструировании промышленных биореакгоров необходимо учитывать такие параметры, как температура, pH, скорость и характер перемешивания, потребность аэробных организмов в кислороде, количество питательных веществ.

Ферментацию можно проводить по-разному. При периодической ферментации посевной материал вводят в свежую культуральную среду и проводят культивирование, не добавляя субстрат до тех пор, пока количество нужного продукта не достигнет максимума. В этих условиях рост культуры проходит шесть этапов: латентную фазу, фазу ускорения, логарифмическую (log) фазу, фазу замедления, стационарную фазу и фазу отмирания. Больше всего белков синтезируется во время логарифмической фазы, а многие низкомолекулярные продукты — во время стационарной. При таком способе ферментации необходимо тщательно следить за тем, чтобы клетки были собраны в нужное время. При периодической ферментации с добавлением субстрата в биореактор добавляют свежую культуральную среду через разные интервалы времени, как правило для того, чтобы продлить логарифмическую фазу. Непрерывная ферментация предполагает добавление свежей среды в течение всего процесса и одновременное удаление клеток и отработанной среды.

Каждая из этих систем ферментации имеет свои недостатки и достоинства, которые нужно учитывать, применяя ее для промышленного синтеза рекомбинантных продуктов. Несмотря на то что непрерывная ферментация применяется в промышленном масштабе не очень широко, этот способ имеет ряд преимуществ и в будущем, по-видимому, получит большее распространение.

Один из подходов к увеличению количества рекомбинантного белкового продукта состоит в максимальном увеличении плотности культуры трансформированных клеток, синтезирующих данный продукт. Для достижения этой цели лучше всего использовать режим периодической ферментации с добавлением субстрата.

Все биореакторы можно отнести к одному из трех основных типов: реакторы с механическим перемешиванием, барботажные колонны, эрлифтные реакторы. В настоящее время в промышленности чаще всего используются биореакторы первого типа, но появляется интерес и к эрлифтным биореакторам. Механическое перемешивание обеспечивается с помощью механической мешалки, а в эрлифтных биореакторах для аэрации и перемешивания используют газ (обычно воздух), который подается под давлением через разбрызгиватель в дне сосуда. При этом во всем объеме происходит непрерывная циркуляция жидкой среды. Барботажные колонны сходны с эрлифтными реакторами, но их недостатком является отсутствие циркуляции культуральной среды. Для обеспечения стерильности, постоянства pH, температуры и других параметров используют разные способы в зависимости от дизайна биореактора. Для синтеза рекомбинантных белков применяют двухступенчатые процессы ферментации, осуществляемые в тандемных эрлифтных биореакторах или в одном реакторе с механическим перемешиванием.

Если синтезированный продукт накапливается в клетках, то их осаждают из культуральной среды центрифугированием или фильтрацией, затем разрушают ферментативными, химическими или механическими методами и выделяют нужный продукт. Если синтезируемый продукт секретируется в культуральную среду, то процедура его выделения и очистки значительно упрощается.

ЛИТЕРАТУРА

Bailey J.E., D.F. Olis. 1977. Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill, New York, N.Y. Charles M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends Biotechnol. 3:134-139.

Datar R, 1986. Economics of primary separation steps in relation to fermentation and genetic engineering. Process Biochem. 21: 19—29.

Engler C.R. 1985. Disruption of microbial cells, p. 305—324. In C.L. Cooney, A.E. Humphrey, M. Moo-Young (ed.), Comprehensive Biotechnology’, vol. 2. Pergamon Press, Oxford, United Kingdom.

Giorgio R.J., J.J. Wu. 1986. Design of large scale containment facilities for recombinant DNA fermentations. Trends Biotechnol. 4: 60—65.

Gosset G., R. de Anda, N. Cruz, A. Marttinez, R. Quintero, F. Bolivar. 1993. Recombinant protein production in cultures of an Escherichia coli trp strain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 541-546.

Grund G., C.W. Robinson, B.R. Glick. 1991. Croos- flow ultrafiltration of proteins, p. 69—83. In M.D. White, S. Reuveny, A. Shafferman (ed.), Biologicals from Recombinant Microorganisms and Animal Cells: Production and Recovery. Verlag Chemie, Weinheim, Germany.

Hart R.A., PM. Lester, D.H. Reifsnyder, J.R. Ogez, S.E. Builder. 1994. Large scale, in situ isolation of periplasmic IGF-1 from E. coli. Bio/Technology 12: 113—117.

Kroner K.H. 1986. Cross-flow filtration in the downstream processing of enzymes: current status. Biotechnol. Forum 3:20—31.

Kroner, K.H., H. Nissinen, H. Zeigler. 1987 Improved dynamic filtration of microbial suspensions. Bio/Technology 5:921—926.

Lee S.Y. 1996. High cell-density culture of Escherichia coli. Trends Biotechnol. 14:98—105.

McKillip E.R., A.S. Giles, M.H. Levner, P.P. Hung, R.N. Njorth. 1991. Bioreactors for large-scale t- PA production. Bio/Technology 9: 805-812.

Mendoza-Vega О., C. Hebert, S.W. Brown. 1994. Production of recombinant hirudin by high cell density fed-batch cultivations of a Saccharomyces cerevisiae strain: physiological considerations during the bioprocess design. J. Biotechnol. 32:249-259.

Merchuk J.C. 1990. Why use airlift bioreactors? Trends Biotechnol. 8:66—71.

Park T.H., J.-H.Seo, H.C. Lim. 1991. Two-stage fermentation with bacteriophage A as an expression vector in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 37:297-302.

Paulson D.J., R.L. Wilson, D.D. Spatz. 1984. Cross- flow membrane technology and its applications. Food Technol. Dec. 1984: 77—87.

RamTrez D.M., W.E. Bentley. 1995. Fed-batch feeding and induction policies that improve foreign protein synthesis and stability by avoiding stress response. Biotechnol. Bioeng. 47: 596-608.

Reuss M. 1995. Stirred tank bioreactors, p. 207—255. In J.A. Asenjo, J. Merchuk (ed.), Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Robinson D.K., C.P. Chan, C.Yu Ip, P.K. Tsai, J. Tung, T.C. Seamans, A.B. Lenny, D.K. Lee, J. Irwin, M. Silberklang. 1994. Characterization of a recombinant antibody produced in the course of a high yield fed-batch process. Biotechnol. Bioeng. 44: 727—735.

Sauer T., C.W. Robinson, B.R. Glick. 1989. Disruption of native and recombinant Escherichia coli in a high-pressure homogenizer. Biotechnol. Bioeng. 33: 1330—1342.

Sayadi S., M. Nasri, F. Berry, J.N. Barbotin, D. Thomas. 1987. Effect of temperature on the stability of plasmid pTG201 and productivity of xylE gene product in recombinant Escherichia coli: development of a two-stage chemostat with free and immobilized cells. J. Gen. Microbiol. 133: 1901-1908.

Schiigerl K., A. Liibbert. 1995. Pneumatically agitated bioreactors, p. 257—303. In J.A. Asenjo, J. Merchuk (ed.), Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Schütte H., M.-R. Kula. 1990. Pilot- and process-scale techniques for cell disruption. Biotechnol. Appl. Blochem. 12: 599—620.

Seigel R., D.D.Y. Ryu. 1985. Kinetic study of instability of recombinant plasmid pPLc23trpAI in E. coli using two-stage continuous culture system. Biotechnol. Bioeng. 27: 28—33.

Siegel M.H., H. Hallaille, J.C. Merchuk. 1988. Airlift reactors: design, operation, and applications. Adv. Biotechnol. Processes 7: 79—124.

Strandberg L., K. Köhler, S.-O. Enfors. 1991. Large-scale fermentation and purification of a recombinant protein from Escherichia coli. Process Biochem. 26: 225—234.

Strandberg L., L. Andersson, S.-O. Enfors. 1994. The use of fed batch cultivation for achieving high cell densities in the production of a recombinant protein in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev. 14: 53—56.

Strathman H. 1985. Membranes and membrane processes in biotechnology. Trends Biotechnol. 3: 112-118.

Tanny G.B., D. Mirelman, T. Pistole. 1980. Improved filtration techniques for concentrating and harvesting bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 40: 269-273.

Tutunjian R.S. 1985. Scale-up considerations for membrane processes. Bio/Technology 3: 615-626.

Van Brunt J. 1985. Scale-up: the next hurdle. Bio/Technology 3: 419—424.

Van Brunt J. 1986. Fermentation economics. Bio/Technology 4: 395—401.

White M.D., B.R. Glick, C.W. Robinson. 1995. Bacterial, yeast and fungal cultures: the effect of microorganism type and culture characteristics on bioreactor design and operation, p. 47—87. In J.A. Asenjo, J. Merchuk (ed.), Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Whitney, G.D., B.R. Glick, C.W. Robinson. 1989. Induction of T4DNA ligase in a recombinant strain of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 33: 991-998.

Yamane T. 1995. Bioreactor operation modes, p. 479—509. In J.A. Asenjo and J. Merchuk (ed.), Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. В чем различия между периодической ферментацией, периодической ферментацией с добавлением субстрата и непрерывной ферментацией?

2. Какие параметры необходимо строго контролировать при оптимизации процесса ферментации?

3. Как влияет присутствие в клетке рекомбинантной плазмиды на ее рост?

4. Как влияет перемешивание на доставку кислорода из культуральной среды к клеткам?

5. Для чего нужно стремиться максимально повысить плотность культуры при промышленной ферментации?

6. Каковы относительные преимущества и недостатки биореакторов с механическим перемешиванием и эрлифтных биореакторов?

7. Сравните процедуры выращивания и индукции культуры рекомбинантных микроорганизмов в двух тандемных биореакторах и в одном реакторе.

8. Какой обработке подвергают клеточную суспензию по завершении ферментации?

9. Какую стратегию вы бы выбрали для очистки рекомбинантного белка, секретируемого в культуральную среду?

10. Каковы преимущества и недостатки механического разрушения клеток по сравнению с химическим?

11. Как собирают клетки по завершении ферментации? Каковы преимущества и недостатки соответствующих методов?