Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Генная инженерия растений: методология
Векторные системы на основе Ті-плазмид

Самый простой способ использования природной способности Ті-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Ті-плазмид и A. tumefaciens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ті-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования.

✵ Фитогормоны, синтезируемые трансформированными клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого растения, поэтому при конструировании векторов на основе Ti-плазмиды гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

✵ Ген опина несуществен для трансгенных растений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Следовательно, при создании векторов ген опина также должен быть удален.

✵ Ti-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

✵ Ti-плазмиды не реплицируются в Escherichia coli, что исключает работу с рекомбинантными Ті-плазмидами в этих бактериях. Следовательно, при конструировании векторов на

основе Ті-плазмид необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в Е. coli.

Несмотря на все эти сложности было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Ті-плазмид организованы сходным образом и имеют следующие элементы.

✵ Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину. Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации-полиаденилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках.

✵ Сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens.

✵ Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности.

✵ Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода. В первом случае используют бинарную векторную систему (рис. 17.6, А). Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации и для Е. coli, и для A. tumefaciens, но не несет генов vir, т. е. это практически челночный вектор Е. coli — A. tumefaciens. Все стадии клонирования проводят в Е. coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens. Штамм-реципиент A. tumefaciens несет модифицированную неонкогенную («разоруженную») Ті-плазмиду; она содержит полный набор vir-генов, но из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК (так что Т-ДНК не может быть транспортирована). В этой системе на неонкогенной Ті-плазмиде синтезируются продукты vir-генов, которые мобилизуют участок Т-ДНК бинарного клонирующего вектора. Продуцируя белки, кодируемые vir-генами, неонкогенная Ті-плазмида выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения.

Рис. 17.6. Две векторные системы на основе Ті-плазмид. А. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации (оrі) и для Е. coli. и для A. tumefaciens (либо сайт инициации репликации для широкого круга хозяев), селективный маркерный ген, который может быть использован либо в Е. coli, либо в A. tumefaciens, а также интересующий исследователя ген и растительный селективный маркерный ген, встроенные в T-ДНК. Б. Коинтегративный клонирующий вектор (вверху) содержит сайт инициации репликации только для Е. coli и не может автономно существовать в A. tumefaciens. Он также несет селективный маркерный ген, который используется либо в Е. coli, либо в A. tumefaciens. правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П). растительный селективный маркерный ген, ген, который нужно ввести в геном, и фрагмент Ti-плазмиды, гомологичный участку ДНК неонкогенной («разоруженной») Ti-плазмиды. Неонкогенная Ті-плазмида (в середине) содержит левую фланкирующую последовательность Т-ДНК (Л), кластер vir-генов и сайт инициации репликации A. tumefaciens (оrі). Гомологичная рекомбинация коинтегративного клонирующего вектора с неонкогенной Ті-плазмидой дает рекомбинантную плазмиду (внизу), которая несет клонированный ген и растительный репортерный ген, фланкированные правой и левой концевыми последовательностями Т-ДНК.

Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Векторная ДНК рекомбинирует в A. tumefaciens с «разоруженной» Ті-плазмидой, Т-ДНК которой не несет опухолеродных генов, таким образом, что весь клонирующий вектор встраивается в неонкогенную Ті-плазмиду (рис. 17.6, Б). Коинтегративный вектор и неонкогенная Ті-плазмида-помощник содержат гомологичные последовательности, которые образуют сайт для гомологичной рекомбинации in vivo. Обычно эти последовательности расположены в Т-ДНК. После рекомбинации клонирующий вектор становится частью неонкогенной Ті-плазмиды, которая содержит vir-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскую клетку. Единственный способ поддержания клонирующего вектора в A. tumefaciens — это использование такой коинтегративной структуры. В данной конфигурации генетически сконструированный участок Т-ДНК может быть перенесен в растительные клетки.