Молекулярная биология клетки - Том 2 - Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. 1993
Межклеточная сигнализация
Механизм действия циклического AMP и ионов кальция
Так как сАМР и Са2+-возможно, самые важные внутриклеточные посредники, появляющиеся в результате активации рецепторов клеточной поверхности, механизм их действия заслуживает специального рассмотрения. Оба они действуют как аллостерические эффекторы - активируют определенные белки, присоединяясь к ним и изменяя их конформацию.
12-21
12.4.1. с AMP активирует сАМР-зависимую протеинкиназу [23]
В животных клетках сАМР действует главным образом путем активации специфического фермента, называемого сАМР-зависимой протеинкиназой (А-киназой). Этот фермент катализирует перенос концевого фосфата с АТР на определенные остатки серина и треонина в некоторых белках клетки-мишени. Остатки, фосфорилируемые А-киназой, отличаются тем, что со стороны N-конца около них расположены две или большее число основных аминокислот. Ковалентнеє фосфорилирование таких остатков в свою очередь регулирует активность этих белков.
Впервые сАМР-зависимое фосфорилирование белков было выявлено при изучении метаболизма гликогена в клетках скелетных мышц. Гликоген - это основная резервная форма глюкозы; как уже упоминалось, его распад в мышечных клетках регулируется адреналином (фактически адреналин регулирует как распад гликогена, так и его синтез в скелетной мускулатуре). Если, например, животное подвергнуть стрессу (испугать и т. п.), то надпочечники начнут выбрасывать адреналин в кровь, и это будет приводить различные ткани организма в состояние «готовности». Циркулирующий в крови адреналин вызывает, в частности, расщепление гликогена в мышечных клетках до глюкозо-1-фосфата и в то же время подавляет синтез нового гликогена. Глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат, который затем окисляется в реакциях гликолиза с образованием АТР, обеспечивая энергию для интенсивной работы мышц. Таким способом адреналин подготавливает мышечные клетки к усиленной работе.
Рис. 12-26. На этой схеме показано, как повышение уровня сАМР в клетках скелетных мышц (при связывании адреналина с ß-адренэргическими рецепторами клеточной поверхности) стимулирует распад гликогена. Связывание сАМР с А-киназой активирует этот фермент, который в свою очередь фосфорилирует и тем самым активирует киназу фосфорилазы, а она фосфорилирует (и активирует) гликогенфосфорилазу - фермент, расщепляющий гликоген. А-киназа также прямо и опосредованно усиливает фосфорилирование гликогенсинтетазы (которая при этом ингибируется), и это ведет к прекращению синтеза гликогена (не показано).
Как уже говорилось, на поверхности мышечных клеток адреналин связывается с ß-адренэргическими рецепторами, что ведет к активации аденилатциклазы и повышению уровня сАМР в цитозоле. сАМР активирует А-киназу, и она фосфорилирует другой фермент-киназу фосфорилазы (первую протеинкиназу, которую удалось получить в очищенном виде в 1959 г.). Эта последняя в свою очередь фосфорилирует (и тем самым активирует) гликогенфосфорилазу, отщепляющую остатки глюкозы от молекулы гликогена (рис. 12-26). Активированная А-киназа, кроме того, усиливает фосфорилирование гликогенсинтазы - фермента, осуществляющего последний этап синтеза гликогена из глюкозы, фосфорилирование инактивирует гликогенсинтазу и прекращает синтез гликогена. С помощью такого каскада взаимодействий повышение уровня сАМР приводит одновременно как к уменьшению синтеза гликогена, так и к усилению его распада, что максимально увеличивает количество глюкозы, доступной для использования клеткой.
В некоторых животных клетках повышение уровня сАМР активирует транскрипцию специфических генов. В нейроэндокринных клетках гипоталамуса (разд. 12.1.2), например, сАМР «включает» ген, кодирующий пептидный гормон соматостатин. В промоторной области гена соматостатина есть короткая последовательность ДНК (около 30 нуклеотидов), найденная также в промоторах ряда других генов, активируемых сАМР. Эта последовательность узнается специфическим регуляторным белком, который, будучи фосфорилирован А-киназой, активирует транскрипцию этих генов.
В неактивном состоянии А-киназа - это комплекс из двух регуляторных субъединиц, связывающих сАМР, и двух каталитических субъединиц. Связывание сАМР изменяет конформацию регуляторных субъединиц, что приводит к отделению их от комплекса. Освобожденные каталитические субъединицы и представляют собой активную А-киназу; они фосфорилируют молекулы белков-субстратов (рис. 12-27).
А-киназа имеется во всех животных клетках, и полагают, что почти все эффекты, вызываемые сАМР, реализуются благодаря ей. Хотя большинство ее белков-субстратов еще не охарактеризовано, ясно, что многие из них в клетках разных типов различны, и это позволяет понять, почему сАМР неодинаково влияет на разные клетки-мишени.
Рис. 12-27. Активация сАМР-зависимой протеинкиназы (А-киназы). Присоединение сАМР к регуляторным субъединицам фермента вызывает изменение их конформации, приводящее к отделению этих субъединиц от комплекса. Освобождаемые при этом каталитические субъединицы активируются. Каждая регуляторная субъединица имеет два участка для связывания сАМР, и освобождение каталитических субъединиц представляет собой кооперативный процесс, требующий присоединения более чем двух молекул сАМР на тетрамер. Это делает реакцию киназы на изменение концентрации сАМР значительно более резкой (см. разд. 12.4.8). Во многих клетках имеются А-киназы двух типов-с одинаковыми каталитическими субъединицами, но разными регуляторними.
12.4.2. сАМР ингибирует внутриклеточную протеинфосфатазу [24]
Так как эффекты сАМР обычно непродолжительны, ясно, что клетка способна дефосфорилировать белки, фосфорилированные А-киназой. Отщепление фосфата катализируют две главные протеинфосфатазы, одна из которых сама регулируется циклическим AMP. Уровень фосфорилирования всегда будет зависеть от баланса между активностями киназ и фосфатаз.
В клетках скелетных мышц с AMP-регулируемая протеинфосфатаза наиболее активна в отсутствие сАМР, и она дефосфорилирует все три ключевых фермента метаболизма гликогена, которые уже упоминались ранее, - киназу фосфорилазы, гликогенфосфорилазу и гликогенсинтазу. Это дефосфорилирование противодействует фосфорилированию белков под действием сАМР. Однако А-киназа в активном состоянии фосфорилирует и тем самым активирует также специальный белок - ингибитор фосфатази. Этот белок присоединяется к фосфопротеинфосфатазе и инактивирует ее (рис. 12-28). Таким образом, А-киназа, активируя киназу фосфорилазы и одновременно подавляя активность фосфопро- теинфосфатазы, намного усиливает и ускоряет воздействие повышенного уровня сАМР на синтез и распад гликогена по сравнению с тем, что было бы, если бы А-киназа действовала лишь на один из этих ферментов.
Рис. 12-28. Циклический AMP ингибирует протеинфосфатазу, которая в активном состоянии противодействовала бы реакциям фосфорилирования, запускаемым сАМР. Он активирует А-киназу, а она фосфорилирует белок-ингибитор, который после этого присоединяется к протеинфосфатазе и подавляет ее активность.
Рис. 12-29. Структура кальмодулина (по данным рентгеноструктурного анализа). Молекула имеет форму гантели с двумя глобулярными юнцами, соединенными длинной открытой а-спиральго. Каждый конец имеет два Са2+-связывающих домена, представляющих собой петли из 12 аминокислотных остатков, в которых боковые цепи аспартата и глутамата образуют ионные связи с Са2+. У двух участков связывания ионов кальция в С-концевой части молекулы сродство к ним в десять раз больше, чем в N-концевой части. (По данным Y. S. Babu et al., Nature 315: 37-40, 1985.)
12-22
12.4.3. Кальмодулин является вездесущим внутриклеточным рецептором для ионов кальция [25]
Поскольку концентрация свободных ионов Са2+ в цитозоле обычно составляет около 10-7 М и, как правило, не поднимается выше 5 ∙ 10-5 М даже при поступлении их извне, любая структура клетки, чтобы быть непосредственной мишенью кальциевой регуляции, должна иметь константу сродства к Са2+ (Ка) порядка 106 л/моль. Если же учесть, что концентрация свободных ионов Mg2+ в цитозоле относительно постоянна и составляет около 10-3 М, то связывающие кальций центры должны обладать по меньшей мере 1000-кратной избирательностью к Са2+ по сравнению с Mg2+. Этим требованиям удовлетворяют несколько специфических Са2+-связывающих белков.
Первым из этих белков был открыт тропонин С в клетках скелетных мышц; роль его в мышечном сокращении обсуждалась в гл. 11 (разд. 11.1.12). Другой, близко родственный ему кальций-связывающий белок-кальмодулин - обнаружен во всех до сих пор изученных клетках животных и растений. Типичная животная клетка содержит более 107 молекул кальмодулина, что может составлять до 1% всего клеточного белка. Кальмодулин функционирует как многоцелевой внутриклеточный рецептор для Са2+, участвующий в большинстве процессов, регулируемых этими ионами. Это очень консервативный одиночный полипептид примерно из 150 аминокислот, имеющий четыре высокоаффинных Са2+- связывающих центра; при связывании кальция он претерпевает большие конформационные изменения (рис. 12-29).
Аллостерическая активация кальмодулина кальцием аналогична активации А-киназы циклическим AMP, с тем отличием что комплекс Са2+-кальмрдулин сам по себе не обладает ферментативной активностью и действует, связываясь с другими белками. В некоторых случаях кальмодулин служит постоянной регуляторной субъединицей ферментного комплекса (как в случае киназы фосфорилазы, см. ниже), но чаще всего связывание Са2+ ведет к присоединению кальмодулина к различным белкам-мишеням и, как следствие, к изменению их активности (рис. 1230).
Рис. 12-30. Здесь показано, каким образом повышение концентрации свободных ионов Са2+ в цитозоле может косвенным образом активировать фермент, изменяя конформацию молекул кальмодулина. Подобно связыванию сАМР с А-киназой, связывание Са2+ с калъмо-дулином кооперативно: для активации этого белка требуется больше одного иона Са2+ (см. разд. 12.4.8).
К числу мишеней, регулируемых комплексом Са2+-кальмодулин, относится много ферментов и мембранных транспортных белков. Среди них выделяются Са2+/кальмодулин-зависимые протеинкиназы (Са-киназы), фосфорилирующие белки по остаткам серина и треонина. Первые из открытых Са-киназ-киназа легких цепей миозина и киназа фосфорилазы - имели узкую субстратную специфичность. Позже была идентифицирована широкоспецифичная Са-киназа, называемая Са2+/калъмодулин-регулируемой «полифункциональной» киназой (или Са-киназой II); она может служить посредником во многих эффектах Са2+ в клетках млекопитающих. Как и в случае сАМР, ответ клетки-мишени на повышение концентрации свободного Са2+ в цитозоле определяется тем, какие Са2+/кальмодулин-регулируемые белки имеются в клетке.
12.4.4. Пути с участием сАМР и Са2+ взаимодействуют между собой [26]
Пути с участием вторичных посредников сАМР и Са2+ взаимодействуют по крайней мере тремя способами. Во-первых, внутриклеточные уровни Са2+ и сАМР влияют друг на друга. Например, комплексы Са2+/кальмодулин связываются с ферментами, которые разрушают или синтезируют сАМР,-с сАМР-фосфодиэстеразой и аденилатциклазой соответственно - и регулируют их активность; а в свою очередь А-киназа способна фосфорилировать некоторые кальциевые каналы и насосы и изменять их активность. Во-вторых, некоторые Са-киназы фосфорилируются А-киназой. В-третьих, А-киназа и Са-киназы нередко фосфорилируют различные участки одного белка, который, таким образом, регулируется сразу и циклическим AMP, и ионами Са2+.
В качестве примера взаимодействия путей Са2+ и сАМР рассмотрим киназу фосфорилазы скелетных мышц, роль которой в расщеплении гликогена мы уже обсуждали. Эта киназа фосфорилирует гликогенфосфорилазу, расщепляющую гликоген (см. рис. 12-26). Киназа фосфорилазы - мультисубъединичный фермент, но только одна из его четырех субъединиц фактически катализирует фосфорилирование: три другие - регуляторные и дают комплексу возможность активироваться и циклическим AMP, и ионами кальция. Каждая из четырех субъединиц, обозначаемых а, ß, у и 5, представлена в комплексе четырьмя копиями. у-Субъединица осуществляет катализ; чувствительность фермента к Са2+ определяется в основном 5 -субъединицей-кальмодулином; субъединицы же а и ß - мишени для сАМР-зависимой регуляции; обе они фосфорилируются А-киназой (рис. 12-31).
Тот же Са2+-сигнал, который инициирует мышечное сокращение, обеспечивает и достаточный для этого источник энергии в виде глюкозы. Массированный выброс в цитозоль ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулума, вызывающий сокращение миофибрилл (разд. 11.1.11), одновременно повышает активность киназы фосфорилазы, изменяя конформацию ее 5-субъединицы, и в результате скорость расщепления гликогена за несколько секунд увеличивается в сотни раз. Кроме того, выброс Са2+ активирует две Са-киназы, которые фосфорилируют и ингибируют гликогенсинтазу, прекращая синтез гликогена. Рассмотренная выше цепь реакций фосфорилирования, запускаемая в мышечных клетках адреналином, заранее приспосабливает их метаболизм к повышенным энергозатратам; так, например, фосфорилирование киназы фосфорилазы А-киназой делает ее более чувствительной к Са2+ -для активации требуется теперь меньшее число ионов кальция, связанных с кальмоду лином.
Рис. 12-31. Сильно схематизированное изображение четырех субъединиц киназы фосфорилазы из мышц млекопитающих. Каталитической активностью обладает у-субъединица; а- и ß-субъединицы участвуют в регуляции этой активности циклическим AMP, а 5-субъединица (кальмодулин)-в ее регуляции ионами Са2+. В действительности полный ферментный комплекс содержит по четыре копии каждой субъединицы.
Используя двумерный гель-электрофорез, в эукариотических клетках удается выявить сотни различных фосфорилированных белков. Лишь малая их часть фосфорилируется известными киназами, большинство же киназ еще ждет своего открытия. Действительно, по оценкам, одна клетка млекопитающего может содержать более 100 различных протеинкиназ, регулирующих мириады внутриклеточных реакций. Помимо фосфорилирования существует и много других обратимых ковалентных модификаций, регулирующих активность белков, например метилирование - деметилирование, ацетилирование - деацетилирование, уридилирование-деуридилирование, аденилирование-деаденилирование. Кажется вероятным, что активность большинства клеточных белков, катализирующих протекание скорость-лимитирующих этапов в биологических процессах, регулируется с помощью той или иной из этих модификаций. Если же учесть, насколько сложны могут быть обратные связи в одном только метаболизме гликогена, станет ясно, что раскрытие механизмов этих важных регуляторных процессов представляет собой сложную задачу.
12-16
12.4.5. cGMP тоже служит внутриклеточным посредником [27]
сАМР - не единственный циклический нуклеотид, используемый для внутриклеточной сигнализации. Большинство животных клеток содержит также циклический гуанозинмонофосфат (cGMP, рис. 12-32), хотя его концентрация по крайней мере в 10 раз меньше концентрации сАМР. Известно, что cGMP служит активатором специфической протеинкиназы (G-киназы), фосфорилирующей в клетке определенные белки (см. рис. 12-25), однако роль циклического GMP в передаче сигналов от рецепторов клеточной поверхности, за несколькими исключениями, не ясна. Гуанилатциклаза, катализирующая образование cGMP из GTP, в отличие от аденилатциклазы обычно является растворимым ферментом и не сопряжена явным образом с поверхностными рецепторами, хотя уровень cGMP часто повышается при активации инозитолфосфолипидного пути. Однако недавно в некоторых клетках были обнаружены формы гуанилатциклазы, связанные с плазматической мембраной, которые либо сопряжены с поверхностными рецепторами, либо сами выполняют их функцию.
Лучше всего сигнальная роль cGMP выяснена в реакции на свет палочек в сетчатке позвоночных, где cGMP прямо воздействует на Na+-каналы плазматической мембраны. В отсутствие света молекулы cGMP связаны с натриевыми каналами и удерживают их в открытом состоянии. Свет активирует в мембранных дисках палочек родопсин; активированный родопсин взаимодействует с G-белком трансдуцином, также активируя его. а-Субъединица трансдуцина (Та) в свою очередь активирует cGMP-фосфодиэстеразу, которая гидролизует cGMP, резко снижая его концентрацию в цитозоле, и молекулы cGMP, связанные с натриевыми каналами, отделяются от них, позволяя им закрыться. Таким образом, световой сигнал преобразуется в электрический (подробнее см. разд. 19.6.7). Это прямое управление ионными каналами, осуществляемое сGМР, - один из немногих известных случаев, когда циклический нуклеотид в клетках позвоночных действует независимо от протеинкиназы. Но этот случай не единственный; другой такой пример - обонятельные рецепторные клетки носа. Связывание некоторых пахучих веществ со специфическими рецепторными белками в этих клетках активирует (через одну из форм G5-белка) аденилатциклазу; это ведет к повышению концентрации сАМР в цитозоле, и сАМР непосредственно воздействует на натриевые каналы плазматической мембраны, открывая их и вызывая тем самым деполяризацию.
Рис. 12-32. Циклический GMP.
Несмотря на разницу в молекулярных деталях, все сигнальные системы, запускаемые рецепторами, сопряженными с G-белками, имеют ряд общих черт и основаны на сходных принципах. Все они, например, представляют собой сложные каскады или передаточные цепочки внутриклеточных посредников. Каковы же преимущества таких на первый взгляд запутанных систем, что они используются в столь многих типах клеток для столь разнообразных целей?
12.4.6. Использование вторичных посредников и ферментных каскадов позволяет в огромной степени усиливать реакцию на внеклеточные сигналы [28]
В отличие от более прямых сигнальных систем, таких как системы стероидных гормонов, каталитические каскады внутриклеточных посредников предоставляют много возможностей для усиления и регулирования ответов на внеклеточные сигналы. Из рис. 12-33 видно, что, например, когда внешний лиганд активирует аденилатциклазу опосредованно, связываясь с рецептором, одна молекула рецептора может активировать много молекул Сs-белка, каждая из которых способна активировать молекулу циклазы. В свою очередь каждая молекула аденилатциклазы превращает множество молекул АТР в сАМР. Такого же рода усиление происходит и в инозитолфосфо липидном пути. В результате наномолярные (10-9 М) концентрации внеклеточного лиганда нередко вызывают образование вторичных посредников, таких как сАМР или Са2+, в микромолярных (10~6 М) концентрациях. Так как сами эти молекулы являются аллостерическими эффекторами, активирующими определенные ферменты, одна внешняя сигнальная молекула способна вызвать изменения во многих тысячах молекул внутри клетки-мишени. Кроме того, каждый белок в такой цепи может служить независимой мишенью для регуляторного воздействия, как, например, в каскаде расщепления гликогена в скелетных мышцах (разд. 12.4.1).
Работа такого рода «взрывных» метаболических каскадов должна жестко регулироваться. Не удивительно поэтому, что клетки обладают эффективными механизмами для быстрого расщепления сАМР и для понижения концентрации Са2+, а также для инактивации ферментов и транспортных белков, активированных при ответе на сигнал. Ясно, что быстрое удаление или инактивация сигнальных молекул необходимы для выключения клеточного ответа; менее очевидно то, что они столь же важны и для его быстрого включения.
12-25
12.4.7. Концентрация какого-либо вещества может быстро изменяться лишь в том случае, если оно имеет короткое время жизни [29]
Если для клетки важно очень быстро изменять концентрацию каких-либо молекул (например, с AMP или Са2+), то эти молекулы должны непрерывно разрушаться или быстро удаляться каким-нибудь иным способом - другими словами, подвергаться быстрому обновлению. Рассмотрим, например, два внутриклеточных вещества X и Y, каждое из которых обычно представлено в клетке тысячей молекул. Пусть X имеет низкую оборачиваемость - каждую секунду разрушается и синтезируется 10 молекул X; таким образом, среднее время жизни молекулы в клетке 100 с. Скорость синтеза и распада Y в 10 раз больше, т.е. 100 молекул в секунду, и соответственно время жизни молекулы Y равно 10 с. Если скорость синтеза обоих веществ увеличится в 10 раз, а скорость разрушения останется неизменной, то спустя 1 с число молекул Y в клетке возрастет почти на 900 (10-100 — 100), а число молекул Х-всего лишь на 90. В общем случае время, за которое концентрация каких-либо молекул пройдет половину пути от прежней равновесной концентрации до новой после ускорения или замедления их синтеза, равно обычному времени полужизни этих молекул - времени, за которое концентрация их уменьшилась бы вдвое, если бы их синтез прекратился (рис. 12-34).
Рас. 12-33. Сопряжение поверхностных рецепторов с активацией аденилатциклазы через G-белок позволяет не только преобразовывать внеклеточный сигнал во внутриклеточный, но и многократно его усиливать. Такого же рода усиление происходит при активации инозитолфосфолипидного пути. На первом этапе усиления для активации множества молекул Gs-белка вовсе не обязательно длительное связывание сигнального лиганда с рецептором (см. разд. 12.3.5).
Этот принцип справедлив как для малых молекул, так и для белков, как для внутриклеточных, так и для внеклеточных веществ. Время полужизни многих внутриклеточных белков, подвергающихся быстрому расщеплению или ковалентной модификации, составляет 2 ч и меньше, а у некоторых оно не превышает 10 мин. В большинстве случаев это белки с ключевыми регуляторними функциями, и концентрация их в клетке легко контролируется изменением скорости их синтеза.
Рис. 12-34. Относительная скорость изменения внутриклеточной концентрации молекул с различным временем полуобновления при уменьшении (А) или увеличении (Б) скорости их синтеза в 10 раз (теоретические кривые). В обоих случаях концентрация молекул, быстро разрушающихся в клетке (цветные линии), изменяется быстро, а концентрация молекул с большими периодами полуобновления - пропорционально более медленно. Цветные цифры справа - время полужизни различных молекул.
12.4.8. Клетки могут резко отвечать на плавное повышение концентрации внеклеточного сигнала [30]
Некоторые реакции клеток на сигнальные молекулы бывают плавными (градуальными) и усиливаются прямо пропорционально увеличению концентрации лиганда. Таковы обычно первичные ответы клеток на стероидные гормоны, вероятно потому, что каждый рецепторный белок связывает одну молекулу гормона, а каждая специфическая узнаваемая последовательность ДНК в гормоночувствительном гене действует независимо (разд. 12.2.1). С повышением концентрации гормона пропорционально возрастает концентрация гормон-рецепторных комплексов, а значит, и число этих комплексов, присоединившихся к специфическим участкам генома. Клеточный ответ в этом случае будет градуальным и линейным.
Однако другие реакции клеток на увеличение концентрации сигнальных молекул могут начинаться более резко, а некоторые - даже практически по типу «всё или ничего». В последнем случае не наблюдается никакого ответа до тех пор, пока концентрация лиганда не достигнет определенного порогового уровня, а после достижения этого уровня сразу развивается максимальная реакция. Например, некоторые факторы роста действуют как сигналы типа «всё или ничего», заставляя клетку приступить к репликации ДНК, предшествующей клеточному делению. Каковы могут быть молекулярные основы такого резкого или даже внезапного ответа на плавно изменяющийся сигнал?
Один из возможных механизмов основан на принципе кооперативности, когда для активации какой-то макромолекулы-мишени необходимо присоединение к ней двух или нескольких внутриклеточных эффекторов (или их комплексов с рецептором). Например, при некоторых реакциях на стероидные гормоны для активации надлежащего гена, по-видимому, требуется одновременное связывание со специфическим участком хроматина нескольких гормон-рецепторных комплексов. В результате при увеличении концентрации гормона ген активируется более резко, чем если бы для его активации было достаточно одного такого комплекса (рис. 12-35). Аналогичный механизм кооперативности действует при активации с участием А-киназы и кальмодулина; поскольку кальмодулин принимает активирующую конформацию только тогда, когда он свяжет два или больше ионов Са2+ (см. рис. 12-30), повышение внутриклеточной концентрации этих ионов всего лишь в 10 раз вызывает уже 50-кратное усиление активации. Такие кооперативные реакции становятся тем более резкими, чем больше молекул-эффекторов нужно для активации молекулы-мишени, и если их число становится достаточно большим, то дело может дойти до реакции типа «всё или ничего» (рис. 12-36 и 12-37).
Рис. 12-35. Наблюдаемый ответ клеток куриного яйцевода на стероидный гормон эстрадиол. Активированные рецепторы эстрадиола переходят в ядро и включают транскрипцию нескольких генов. Показана зависимость реакции от доли активированных рецепторов для двух из этих генов, кодирующих белки яйца - кональбумин и овальбумин. Линейная зависимость для кональбумина указывает на то, что ген этого белка включается одной молекулой активированного рецептора. Напротив, замедленное начало синтеза овальбумина с последующим крутым подъемом кривой означает, что для запуска транскрипции овальбуминового гена, вероятно, необходимо присоединение к нему более одной молекулы активированного рецептора (в данном случае двух молекул). (Из Е. R. Mulvihill, R. D. Palmiter, J. Biol. Chem. 252: 2060-2068, 1977, с изменениями.)
Ответы становятся намного более резкими и в том случае, если лиганд активирует один фермент и одновременно подавляет активность другого, катализирующего обратную реакцию. Мы уже рассмотрели один пример такого регуляторного принципа, когда говорили о стимуляции распада гликогена в мышечных клетках, где повышение уровня сАМР одновременно активирует киназу фосфорилазы и ингибирует фосфопротеинфосфатазу, действующую в противоположном направлении (разд. 12.4.1, 12.4.2).
Другая возможная причина реакции типа «всё или ничего» на постепенное повышение концентрации сигнального лиганда - механизм положительной обратной связи. С помощью этого механизма нервные и мышечные клетки генерируют по принципу «всё или ничего» потенциалы действия при связывании нейромедиаторов. Например, при активации ацетилхолиновых рецепторов нервно-мышечного соединения в плазматической мембране мышечной клетки открываются каналы для катионов, и переходящие внутрь клетки ионы Na+ вызывают местную деполяризацию мембраны. Если эта деполяризация достигает определенного порогового уровня, в том же участке мембраны открываются потенциалзависимые натриевые каналы, что приводит к дальнейшему притоку натрия; в результате деполяризация усиливается, это приводит к открытию еще большего числа натриевых каналов и т. д. Так возникает потенциал действия, который распространяется по всей мембране мышечной клетки.
Рис. 12-36. Как видно из этого графика, кривые с крутым подъемом типа «всё или ничего» получаются в тех случаях, когда для активации макромолекулы-мишени необходимо присоединение к ней нескольких молекул-эффекторов. Приведены теоретические кривые для случаев активации при одновременном связывании различного числа (1, 2, 8 и 16) зффекторных молекул.
Рис. 12-37. Схема одного из возможных сигнальных механизмов, при котором следует ожидать реакции с резким порогом. В данном примере для образования активного белкового комплекса необходимо одновременное связывание восьми молекул сигнального лиганда. При низких концентрациях лиганда число активных комплексов будет возрастать пропорционально примерно восьмой степени концентрации.
Такой механизм положительной обратной связи может регулировать работу не только ионных каналов, но и рецепторов, действующих как ферменты. Представим себе, что некий сигнальный лиганд активирует фермент и что две или больше молекул продукта ферментативной реакции вновь связываются с тем же ферментом и еще больше активируют его (рис. 12-38). Количество продукта такого фермента будет расти очень медленно, пока концентрация активирующего лиганда не достигнет пороговой величины, при которой накопится достаточно продукта, чтобы вызвать самоускоряющуюся активацию фермента. В этот момент концентрация продукта начнет резко возрастать. Благодаря такому механизму клетка может отвечать на постепенное изменение концентрации сигнального лиганда скачкообразным изменением количества определенного метаболита.
Механизм, проиллюстрированный на рис. 12-38, в принципе относительно прост, но он имеет важную особенность, которая делает его непригодным для одних целей и чрезвычайно ценным для других, Если такая система была «включена» в результате достаточного повышения концентрации сигнального лиганда, то она, как правило, продолжает находиться в этом состоянии даже тогда, когда сигнал падает ниже порогового уровня: вместо того чтобы все время отражать текущую величину сигнала, система обнаруживает своего рода «память». В качестве примера можно привести Са2+/кальмодулин-регулируемую полифункциональную протеинкиназу (разд. 12.4.3), которая, видимо, работает как активируемый ионами Са2+ молекулярный переключатель. При активации комплексами Са2+/кальмодулин эта киназа помимо других клеточных белков фосфорилирует также и сама себя. В результате такого самофосфорилирования ее активность становится независимой от ионов кальция и сохраняется на повышенном уровне дольше, чем вызвавший это повышение кальцевый сигнал. Такое состояние поддерживается до тех пор, пока не возрастет активность клеточных фосфатаз и фермент не будет ими «выключен».
Заключение
Непрерывное и быстрое удаление из клетки свободных ионов Са2+ и сАМР делает возможными быстрые изменения концентраций этих двух внутриклеточных медиаторов в ответ на внеклеточные сигналы. Повышение уровня сАМР активирует сАМР-зависимые протеинкиназы (А-киназы), которые фосфорилируют определенные белки-мишени. Этот эффект обратим, так как при падении уровня сАМР фосфорилированные белки быстро дефосфорилируются. Аналогичным образом, повышение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция влияет на клетки благодаря связыванию Са2+ с кальмодулином, который при этом изменяет свою конформацию; комплекс Са2+/кальмодулин активирует много различных белков-мишеней, в том числе Са2+ /кальмодулин-зависимые протеинкиназы (Са2+-киназы). Клетки каждого типа имеют свой характерный набор таких белков-мишеней, поэтому изменение уровня сАМР и Са2+ вызывает в клетках разного типа различные, характерные для каждого типа реакции. Использование с AMP и Са2+ в качестве вторичных посредников позволяет во много раз усиливать реакцию на внеклеточный сигнал и регулировать ее разнообразными способами.
Рис. 12-38. Схема механизма с «ускоряющей положительной обратной связью». Начальное связывание сигнального лиганда активирует фермент, а затем продукт ферментативной реакции связывается с самим ферментом, еще больше повышая его активность.