ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

9. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Цель работы: выделить из природных субстратов (капустный и огуречный рассол, растения, фрукты, рыночные кисломолочные продукты) чистые культуры мезофильных лактококков и лактобацилл, и определить их свойства.

Выделение чистой культуры микроорганизмов из исследуемого материала включает три этапа:

1) получение накопительной культуры;

2) выделение чистой культуры;

3) определение чистоты выделенной культуры.

9.1. Получение накопительной культуры

Накопительной называют культуру, в которой доминируют представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов. Для получения накопительной культуры необходимо создать элективные условия, которые обеспечат преимущественное развитие выделяемой группы микроорганизмов.

Молочнокислые бактерии (МКБ) весьма требовательны к источникам питания, и не все их представители растут даже в такой богатой питательной среде, как молоко. Поскольку МКБ в отличие от других бактерий устойчивы к спирту, элективной средой для них может также служить неохмеленное сусло, содержащее 10-15 об. % этилового спирта.

С целью получения накопительной культуры мезофильных МКБ источник выделения помещают в пробирку со стерильным обезжиренным молоком и термостатируют в течение 24 ч при температуре 30±1 °С. После инкубации из свернувшегося молока готовят фиксированный окрашенный препарат, просматривают его и при наличии в микроскопической картине клеток, характерных для МКБ, используют для выделения чистой культуры. Обычно для получения накопительной культуры молочнокислых бактерий в пробирки со стерильным обезжиренным молоком делают 2-3 пассажа.

9.2. Выделение чистой культуры

Для выделения чистой культуры МКБ на плотную среду методом Коха делают высев из накопительной культуры. Принцип метода заключается в получении чистой культуры из изолированной колонии, которую считают потомством одной клетки.

С целью получения изолированных колоний МКБ в стерильном физиологическом растворе готовят десятикратные разведения накопительной культуры, после чего стерильной пипеткой наносят одну каплю соответствующего разведения этой культуры (10^-3 или 10^-4) на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри (гидролизованное молоко с 1,5 % агара или сусло-агара). Материал осторожно размазывают стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности среды. Разведение готовят с таким расчетом, чтобы в одной чашке вырастало не более 20-30 колоний. Затем этим же шпателем во второй чашке протирают поверхность плотной среды. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре 30±1 °С в течение 2-3 сут. после чего рассматривают и анализируют выросшие колонии.

Внешний вид и строение колоний являются важными культуральными признаками при определении вида микроорганизмов, так как каждому виду присуща типичная форма колонии. Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и под микроскопом при малом увеличении (8х). В проходящем свете колонии рассматривают со стороны дна чашки. Отмечают величину колоний (точечные - менее 1 мм, мелкие - 1-2 мм, средние - 2-4 мм, крупные - от 4-5 мм и более), их форму (правильная, круглая, неправильная, плоская, сферическая) и прозрачность. В отраженном свете, рассматривая колонию со стороны крышки, определяют цвет, характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, матовая), профиль колонии (выпуклый, плоский, вдавленный).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры:

а) колонии гладкие -S-тип (от англ. smooth - гладкий), характеризующиеся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;

б) колонии шероховатые -R-тип (от англ. rough - шероховатый), характеризующиеся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. mucus - слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией; образуется в процессе диссоциации бактериальных культур.

Для дальнейшей работы с чистой культурой по одной изолированной колонии МКБ пересевают в пробирки со стерилизованным обезжиренным молоком. Посевы термостатируют при оптимальной температуре в течение 18-24 ч (но не более 48 ч).

Примечание. Иногда бывает достаточно одного посева на плотную питательную среду для получения изолированных колоний. Однако чаще посев на плотную среду повторяют 2-3 раза, используя в качестве посевного материала выросшие на чашках отдельные колонии.

9.3. Определение чистоты выделенной культуры

Чистоту выделенной культуры определяют несколькими способами - визуальным, микроскопическим и высевом на ряд питательных сред.

При визуальном методе отмечают однотипный характер роста колоний на плотной среде.

Для микроскопического исследования чистоты культуры готовят фиксированные окрашенные препараты и просматривают их с иммерсионным объктивом. В микроскопическом препарате должны обнаруживаться морфологически и тинкториально однородные клетки.

Чистоту выделенной культуры МКБ проверяют также путем высева на ряд питательных сред, таких как сусло, гидролизованное молоко, питательный агар с мелом или цитратом кальция и др.

9.4. Идентификация выделенной культуры молочнокислых бактерий

Идентификацию выделенных культур МКБ проводят путем изучения их морфологии, культуральных, биохимических и других признаков, присущих каждому виду.

Из рыночных кисломолочных продуктов - творога и сметаны - обычно выделяются мезофильные лактококки.

В капустном и огуречном рассоле доминирующими видами лактобацилл являются L. plantarum, L. brevis, L. fermentum, L. Buchneri.

Морфологические признаки: МКБ имеют форму клеток шаровидную или палочковидную. Шаровидные клетки располагаются одиночно, попарно (диплококки), в виде длинных или коротких цепочек. Палочки различаются по длине и толщине. МКБ грамположительны, в основном неподвижны, не образуют спор и капсул.

Культуральные и физиолого-биохимические признаки. На поверхности плотной питательной среды культуры Lactococcus lactis образуют мелкие (диаметром 1-2 мкм), каплевидные, блестящие, бесцветные колонии с ровными краями. Глубинные колонии имеют форму лодочки или чечевицы. Lactococcus cremoris образуют мелкие округлые колонии с выраженной зернистостью. Культуры Lactococcus diacetylactis на агаре с гидролизованным молоком и лимоннокислым кальцием образуют вокруг колоний зоны просветления, что свидетельствует о наличии фермента цитритазы, характерного для ароматобразующих лактококков.

С целью дифференциации лактококков от энтерококков (молочнокислых кокков кишечного происхождения) проводят ряд дополнительных тестов. В отличие от энтерококков лактококки и лейконостоки не растут в гидролизованном молоке, содержащем 6,5 % NaСl при температуре 45 °С и при рН среды 9,5 (табл. 9.1).

Таблица 9.1. Дифференцирующие признаки лактококков и энтерококков

Оптимальная температура размножения мезофильных лактококков и лактобацилл - от 28 до 32 °С. Активные штаммы лактококков свертывают молоко при оптимальной температуре за 5-7 ч с образованием ровного, плотного сгустка.

Предельную кислотность в молоке определяют путем титрования молока 0,1 н. раствором NaОН после ферментации его исследуемой культурой в течение 7 сут. при оптимальной температуре. У лактококков предельная кислотность не превышает 115-120 °Т, в мезофильных лактобациллах она составляет 160-180 °Т, а в термофильных лактобациллах она может достигать 250-300 °Т.

Молочнокислые бактерии - факультативные анаэробы. Не содержат фермента каталазы, но могут расти в присутствии кислорода воздуха.

Культуральные и биохимические признаки некоторых видов лактококков приведены в табл. 9.2.

Таблица 9.2. Основные культуральные и биохимические признаки лактококков и лейконостокков

*ВС - восстанавливает, свертывает.

Для определения принадлежности выделенных лактобактерий к группе гомо- или гетероферментативных их высевают в среду с глюкозой или лактозой и после термостатирования устанавливают наличие или отсутствие газа в поплавке.

Лактобациллы вида L. plantarum относятся к подроду стрепто- бактерий. Они свертывают молоко за 2-3 сут. предельная кислотность составляет 160-180 °Т. Лактобациллы этого вида растут в гидролизованном молоке, содержащем 6 % NaСl и 20 % желчи, восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко, не образуют аммиака из аргинина. Глюкозу расщепляют по гексозодифосфатному пути с образованием преимущественно молочной кислоты.

Культуральные и биохимические признаки некоторых видов лактобацилл приведены в табл. 9.3.

Лактобациллы видов L. brevis, L. fermentum, L. buchneri относятся к подроду бетабактерий, вызывающих гетероферментативное молочнокислое брожение с образованием молочной и уксусной кислот, этанола и диоксида углерода.

Таблица 9.3. Основные культуральные и биохимические признаки лактобацилл

Р* - порозовение (частичное восстановление).

Бетабактерии не свертывают молоко, но при добавлении в него дрожжевого автолизата их размножение стимулируется, и предельная кислотность может составить от 150 до 160 °Т. Большинство видов бетабактерий образуют аммиак из аргинина, не свертывают лакмусовое молоко и лишь частично его восстанавливают (порозовение).