ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

ПРИЛОЖЕНИЕ

Питательные среды и реактивы, используемые в микробиологической практике

Основой большинства питательных сред являются мясная вода, для дрожжей - пивное сусло, для требовательных к питанию молочнокислых бактерий - гидролизованное молоко, для некоторых - печеночный отвар, перевар Хоттингера и др.

1. Среды для культивирования мезофильных и термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

1.1. Мясопептонный бульон (МПБ). Для приготовления МПБ готовят сначала мясную воду. С этой целью говяжье мясо, освобожденное от костей, жира, сухожилий, режут на мелкие кусочки или пропускают через мясорубку. Измельченное мясо заливают холодной водой из расчета 1 дм3 на 500 г мяса и оставляют на 12-18 ч в холодильнике. На следующий день смесь медленно нагревают на огне и кипятят в течение 15-20 мин, периодически помешивая. Остывшую массу фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доливают воду до первоначального объема. К полученной мясной воде добавляют 1 % пептона, 0,5 % хлорида натрия, до требуемого значения устанавливают рН путем добавления насыщенного раствора натрия гидрокарбоната или 10 %-го раствора натрия гидроксида. Стерилизуют при температуре 121±1 °С в течение 15-20 мин.

1.2. Мясопептонный агар (МПА). К 1 дм³ МПБ перед стерилизацией добавляют 20 г агара и нагревают на слабом огне до полного растворения агара. Горячий МПА фильтруют через ватномарлевый фильтр, устанавливают рН в пределах 7,2-7,4, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при температуре 121±1 °С в течение 20 мин.

МПА можно приготовить из сухого питательного агара, выпускаемого предприятиями микробиологической промышленности. Для этого 50 г порошка сухого питательного агара переносят в закрытый сосуд с 1 дм³ холодной водопроводной воды и кипятят на слабом огне до полного растворения агара в течение 1-2 мин при помешивании. Устанавливают рН среды 7,0-7,2, раствор фильтруют через вату и стерилизуют при температуре 121±1 °С в течение 20 мин.

1.3. Мясопептонный бульон (агар) с глюкозой и дрожжевым экстрактом. К 1 дм мясопептонного бульона (агара) перед стерилизацией добавляют 10 г глюкозы и 2 г дрожжевого экстракта (или 10 см его раствора). Устанавливают рН среды 7,0-7,2 и стерилизуют при температуре 121±1 °С в течение 20 мин.

1.4. Дрожжевой экстракт. 100 г прессованных хлебопекарных дрожжей измельчают и заливают 500 см³ прокипяченной и остуженной до 60 °С водопроводной воды. Смесь помещают в термостат при температуре 58-60 °С на 72 ч и ежедневно встряхивают 1-2 раза. При этом происходит автолиз дрожжевых клеток, ферменты клеток гидролизуют сложные вещества и дрожжевая масса разжижается. Дрожжевой экстракт фильтруют, разливают небольшими порциями и стерилизуют при 121±1 °С в течение 15 мин. Готовый к употреблению экстракт лучше хранить в холодильнике.

2. Среды для культивирования дрожжей и плесневых грибов

Для выявления и количественного учета дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах используют питательные среды, селективность которых достигается низким значением рН и введением антибиотиков широкого спектра действия (тетрациклин, левомицетин, неомицин и др.) для подавления сопутствующей бактериальной флоры.

2.1. Среда Сабуро. К 1 дм³ дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 40 г глюкозы и 10 г пептона. Смесь подогревают на слабом огне до полного расплавления агара. Расплавленную среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял 6,5-6,6. Разливают в колбы и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 121±1 °С.

Среду Сабуро используют как основу для приготовления сред с антибиотиками. Допускается применение среды без антибиотиков при анализе консервированных продуктов на промышленную стерильность.

2.2. Сусло пивное неохмеленное. Готовое неохмеленное пивное сусло разбавляют водой до массовой доли сухих веществ 7-8 %, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 116±1 °С.

2.3. Сусло-агар. К 1 дм³ разбавленного пивного сусла прибавляют 20 г агара. Среду расплавляют на водяной бане и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 116 °С.

3. Среды для культивирования бактерий группы кишечной палочки

3.1. Среда Эндо. 100 см³ мясопептонного агара (рН 7,4) расплавляют и охлаждают до температуры 70 °С. Прибавляют 1 г лактозы (х.ч.), предварительно растворенной в стерильной пробирке с небольшим количеством дистиллированной кипяченой воды.

В отдельных пробирках приготовляют 2-3 см спиртового насыщенного раствора основного фуксина, 10 см³ 10 %-го водного раствора натрия сульфита.

В стерильную пробирку отмеривают 1 см фуксина и добавляют раствор натрия сульфита до обесцвечивания фуксина (бледнорозовый цвет). Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар бледно-розового цвета при застывании становится бесцветным.

Среда Эндо выпускается отечественной микробиологической промышленностью в виде сухого порошка. Среду готовят в день ее использования согласно прописи на этикетке.

3.2. Глюкозопептонная среда Эйкмана. В 100 см³ воды растворяют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 10 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают в пробирки или флаконы с поплавками и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин.

3.3. Среда Кесслера. К 1 дм³ воды добавляют 10 г пептона, 50 см3 свежей бычьей желчи. Смесь кипятят при помешивании до полного растворения пептона, фильтруют через вату, растворяют 2,5 г лактозы, доводят объем до 1 дм³ и устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6). Затем добавляют 2 см³ генцианвиолета, разливают в пробирки или колбы с поплавками и стерилизуют при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Среда Кесслера выпускается отечественной микробиологической промышленностью в виде сухого порошка. В лабораториях ее готовят согласно прописи, указанной на этикетке.

3.4. Среда Симмонса. Среда предназначена для определения способности энтеробактерий утилизировать цитраты.

Приготовление. Компоненты среды растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2-3 мин до полного расплавления агара. Значение рН среды 7,0-7,2. Среду разливают в пробирки по 4 см³ и стерилизуют при температуре 112 °С в течение 20 мин. Перед использованием агар расплавляют в пробирках на водяной бане и остужают их в наклонном виде. Цвет готовой среды оливково-зеленый.

Посев и интерпретация результатов. На цитратный агар Симмонса наносят минимальное количество посевного материала, свободного от среды, на которой выращивались микроорганизмы. Контрольную пробирку оставляют незасеянной. Посевы инкубируют при температуре 37 °С. Учет результатов проводят каждые 24 ч в течение 5 суток. Микроорганизмы, способные утилизировать цитраты, растут на среде Симмонса и изменяют ее цвет из зеленого в синий (положительная реакция), а микроорганизмы, неспособные утилизировать цитраты, не растут на этой среде и не изменяют ее цвета (отрицательная реакция).

3.5. Агар Мак-Конки. Среда используется для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Присутствующая в среде желчь, желчные соли и кристаллический фиолетовый подавляют рост сопутствующей микрофлоры.

Приготовление. Ингредиенты растворяют в воде при кипячении в течение 1 мин с постоянным перемешиванием. Устанавливают рН среды 7,1±0,2. Среду разливают в колбы, укупоривают их ватномарлевыми пробками, сверху закрывают бумажными колпачками и стерилизуют при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Посев и интерпретация результатов. Посев производят штрихом для получения изолированных колоний. Чашки Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Колонии Escherichia coli - красные; Klebsiella mobilis - розовые; энтерококков - красные маленькие, круглые; стафилококков - светло-розовые, непрозрачные; Pseudomonasaeruginosa - зеленокоричневые, флюоресцирующие.

4. Среды для культивирования анаэробов

4.1. Среда Вильсона-Блера. Среда применяется для определения сульфитредуцирующей способности мезофильных анаэробных микроорганизмов, в частности для выявления Clostridium perfringens в пищевых продуктах.

Приготовление. Растворы железоаммонийных квасцов и натрия сульфита готовят на стерильной дистиллированной воде. Раствор натрия сульфита стерилизуют текучим паром в течение 1 ч. К 10 мл расплавленного и охлажденного до температуры 80 °С МПА с глюкозой добавляют 10 мл раствора натрия сульфита и 1 мл раствора железоаммонийных квасцов. Устанавливают рН среды 7,5-7,8. Среду разливают по чашкам Петри.

Посев и интерпретация результатов. Посев инфицированного материала или высев из накопительной среды двухслойным методом. Инкубация в течение 18-24 ч в анаэробных условиях при температуре 37 °С. Сульфитредуцирующие клостридии формируют черные колонии вследствие образования сульфида железа.

5. Красители и реактивы для окраски бактерий по Граму

5.1. Феноловый раствор генциана фиолетового. Генциан фиолетовый - 1 г; этанол 96 %-й - 10 см³; фенол кристаллический - 2 г;

вода дистиллированная - до 100 см³.

5.2. Раствор Люголя. Йодит калия - 2 г; йод кристаллический - 1 г; вода дистиллированная - до 300 см³. Вначале готовят концентрированный раствор йодита калия в 5 см воды, в нем растворяют йод, потом добавляют воду до 300 см³.

5.3. Фуксин Пфейфера. Водный раствор фуксина Циля: 1 см³ карболового фуксина Циля и 9 см³ дистиллированной воды.

5.4. Фуксин Циля. Для приготовления фуксина Циля 1 г основного фуксина растворяют в 10 см 96 %-го этанола, затем добавляют 5 г растворенного в воде фенола и несколько капель глицерина. Объем раствора дистиллированной водой доводят до 100 см³ и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.